Лечение инфицированного панкреонекроза — одна из наиболее сложных проблем современной хирургии. Рост эффективности диагностики и интенсивной терапии привел к тому, что в современных условиях до 80% летальных исходов фиксируют не на начальных этапах развития заболевания, а в фазе септической секвестрации деструктивного панкреатита [1]. Для принятия решения о способе дренирования очага инфекции при гнойно-некротическом парапанкреатите особенно важна объективная информация о состоянии парапанкреатической клетчатки [2, 3]. Однако работ, посвященных изучению морфологической структуры парапанкреатической клетчатки при дренировании гнойно-некротического парапанкреатического очага, в доступной литературе мы не встретили.

Традиционная технология гистологического метода оценки морфологической структуры предполагает активное воздействие на препарат при его фиксации, что требует времени и может изменить параметры микроструктуры исследуемой ткани. Современная хирургия стремится к получению информации о нативной микроструктуре ткани в реальном времени, этим условиям может соответствовать метод оптической когерентной томографии (ОКТ) [4]. В опубликованных ранее работах [5—7] ОКТ-визуализация жировой ткани сопутствует диагностике рака молочной железы и саркомы мягких тканей. Возможность применения ОКТ для оценки состояния парапанкреатической жировой ткани в реальном времени у пациентов с инфицированным панкреонекрозом до сих пор не изучена.

Мы выдвинули следующую гипотезу: жировая клетчатка очага гнойно-некротического поражения в условиях разных методов дренирования различается соотношением долей паренхимы, сосудисто-стромального компонента и участков некротизированной ткани.

Цель исследования — изучение особенности морфометрических и ОКТ-характеристик микроструктуры забрюшинной парапанкреатической жировой клетчатки при пассивном дренировании и в условиях активного перфузионно-аспирационного дренирования инфицированного панкреонекроза.

Проведен сравнительный анализ 74 образцов парапанкреатической жировой клетчатки, полученной у 37 пациентов (24 (65%) мужчины и 13 (35%) женщин) с инфицированным панкреонекрозом и гнойно-некротическим парапанкреатитом. Стадию развития деструктивного панкреатита и наличие инфицированного панкреонекроза определяли по комплексу лабораторных и инструментальных данных в соответствии с Национальными рекомендациями по острому панкреатиту Российского общества хирургов (2014). Для сравнительного анализа морфометрических характеристик клетчатки пациенты и полученные у них образцы ткани были разделены на две группы. 1-ю группу составили 17 пациентов, у которых очаг гнойно-некротической деструкции дренировали пассивным способом — тампоном Пенроза и трубчатыми дренажами. Во 2-ю группу вошли 20 больных, у которых применена технология активного перфузионно-аспирационного дренирования парапанкреатического гнойно-некротического очага [8].

С целью оценки микроструктуры парапанкреатических тканей на 7—8-е сутки после первичной операции и установки дренажа Пенроза (1-я группа) или активной перфузионно-аспирационной системы (2-я группа) у пациентов из очага воспалительной деструкции забирали образцы парапанкреатической жировой ткани размером от 10×10×5 до 15×20×5 мм. Исследуемые образцы ткани локализовались под нижним краем тела и хвоста поджелудочной железы в зоне, непосредственно контактировавшей с тампоном или дренажем. Всего получено 74 образца ткани: 34 у пациентов 1-й группы и 40 у пациентов 2-й группы. После описания макроструктуры и фотосъемки каждого препарата на них тушью отмечали анатомические ориентиры, в частности поверхность, непосредственно контактировавшую с дренажем. Далее часть из них (58%, а именно 22 образца из 1-й группы и 21 образец из 2-й группы) помещали в изотонический раствор хлорида натрия и не позже чем через 2 ч от момента забора исследовали с помощью ОКТ. Все образцы фиксировали в 10% растворе формалина и проводили их гистологическое исследование (рис. 1).

Для получения ОКТ-изображений использовали установку скоростной спектральной ОКТ (Институт прикладной физики РАН, Нижний Новгород) cо следующими характеристиками: рабочая длина волны 1320 нм, мощность излучения на объекте ~5 мВт, разрешение по глубине (в воздухе) ~10 мкм, поперечное разрешение ~15 мкм, скорость сканирования 80 000 А-сканов в с, частота получения двухмерных изображений размером 5,5×1,5 мм (ширина × высота) составляет 40 кадров/с [9, 10]. Анализ ОКТ-изображений и их сопоставление с гистологическими срезами препаратов проводили для того, чтобы установить возможность получения объективных данных о микроструктуре нативной (нефиксированной) парапанкреатической жировой ткани интраоперационно в реальном времени. Для этого на ОКТ-изображениях оценивали отличия в визуальных характеристиках некротизированной ткани, адипоцитов и междольковой соединительной ткани.

С целью морфометрического исследования на криотоме получали гистологические срезы препаратов толщиной 20 мкм, при этом макропрепарат ориентировали таким образом, чтобы направление и локализация среза точно совпадали с локализацией и направлением в проведенном ранее ОКТ-исследовании (рис. 2).

Препараты окрашивали гематоксилином и эозином и по ван Гизону. Гистологические препараты исследованы на микроскопе Leica DM 2500, описаны и пошагово сфотографированы с использованием цифровой камеры Leica DFC 245C. После компьютерной реконструкции пошаговых гистологических срезов каждого из препаратов до получения его панорамного изображения путем склеивания общего изображения из нескольких проводили морфометрический анализ в программе ImageJ 1.46. Изображение масштабировали, затем всю поверхность ткани, обращенную к тампону или дренажу, делили на секторы размером 1×2 мм, ориентированные перпендикулярно поверхности ткани. В площади полученных секторов оценивали доли (в процентах от общей площади анализируемого участка ткани) некроза, адипоцитов, междольковой соединительной ткани.

Для статистической обработки данных использовали программу Statistica 6.0. При сравнении групп по качественному признаку применяли метод Фишера, по количественному признаку критерий — Манна—Уитни (U). Приводимые далее выборочные параметры имеют следующие обозначения: Ме — медиана, Q₁ — верхний квартиль, Q₃ — нижний квартиль, р — статистическая значимость различий. Критический уровень значимости принимали равным 5% (р≤0,05).

При гистологическом исследовании выявлено, что у пациентов обеих групп в забрюшинной парапанкреатической жировой клетчатке развивались выраженные нарушения кровообращения, дистрофия и некробиоз адипоцитов. В то же время в микроструктуре ткани у пациентов двух групп выявлены качественные и количественные отличия. Так, для микроструктуры исследуемой поверхности образцов ткани из 1-й группы, в которой использованы традиционные методы дренирования, характерна относительно небольшая доля жизнеспособной паренхимы, при этом адипоциты и междольковая соединительная ткань локализовались преимущественно не на поверхности препарата, а под выраженным слоем некроза (рис. 3, а,

На ОКТ-изображениях зон препарата, соответствующих некротизированным тканям, преобладали бесструктурные участки с высоким уровнем сигнала (см. рис. 3, в, зона 3), а на участках с паренхимой визуализировался ячеистый структурированный рисунок (см. рис. 3, в, зона 2).

При количественном морфометрическом анализе гистологических срезов образцов из 1-й группы выявлено, что некротизированная ткань занимала значительную часть препаратов и составила 46,2 (35,6; 56,1)%. Волокна междольковой соединительной ткани и сосуды в зоне непосредственного контакта с тампоном составляли от min 2,9 до max 9,1% площади микропрепарата — 5,6 (3,9; 6,1)%. Доля жировых клеток в 7,9 раза превышала долю сосудисто-стромального компонента ткани и составляла 44,6 (41,2; 51,6)%. При этом в поверхностных тканях, контактирующих с тампоном, установленным в оментобурсостому, на глубине до 2 мм волокна стромы жировой ткани и ее паренхима были выражены в наименьшей степени, преобладали участки деструктурированной некротизированной паренхимы с выраженной нейтрофильной инфильтрацией.

В образцах из 2-й группы в микроструктуре ткани также наблюдали участки некроза, полиморфно-клеточную инфильтрацию, выраженные микрососудистые нарушения. Однако выраженность этих процессов качественно и количественно отличалась от таковой образцов из 1-й группы (см. таблицу).

На ОКТ-изображениях поверхностных участков ткани преобладали зоны с ячеистой структурой, характерной для паренхиматозных компонентов ткани (см. рис. 4, в, зона 3), с выраженными элементами стромы ткани (см. рис. 4, в, зона 4) и небольшими бесструктурными фрагментами с высоким уровнем сигнала (см. рис. 4, в, зона 2), соответствующие зонам некроза.

Таким образом, результаты сравнительного морфометрического исследования гистологических срезов из двух групп подтвердили гипотезу, что в микроструктуре парапанкреатической жировой ткани, находящейся в очаге гнойно-некротической деструкции и подвергающейся различным способам дренирования и некрэктомии, соотношение сосудисто-стромального и паренхиматозного компонентов статистически значимо различается.

Сопоставление гистологической картины и ОКТ-изображений участков ткани показало, что некротизированная парапанкреатическая ткань на ОКТ-изображении выглядит бесструктурной и имеет значительно более высокий уровень обратного рассеяния. Жизнеспособная жировая ткань, наоборот, имеет структуру ячеек (сот) из-за минимального сигнала от содержимого жировых клеток и высокого сигнала от прослоек соединительной ткани. Гистотомографические сопоставления позволили установить, что микроструктура образцов нефиксированной в формалине парапанкреатической жировой ткани, включая границу паренхиматозного и некротического компонентов, достаточно точно видна на ОКТ-изображениях. Не имея гистологического заключения, по данным ОКТ, можно было предположить наличие и выраженность некроза в каждом конкретном участке исследуемой ткани. Следует отметить, что метод не требует окрашивания/контрастирования ткани, изображения внутренней структуры ткани строятся в режиме реального времени, получение ОКТ-изображения, включая позиционирование зонда относительно поверхности ткани, занимает несколько секунд.

Морфологические исследования с разным масштабом визуализации продемонстрировали существенные качественные и количественные различия в зависимости от способа дренирования парапанкреатической клетчатки при панкреонекрозе. При активном перфузионно-аспирационном дренировании гнойного очага более выраженно, чем при пассивном дренировании, снижается объемная плотность некротизированных тканей и увеличивается объемная плотность сосудов и стромы жировой ткани. Этот факт имеет большое клиническое значение, так как именно своевременное удаление очагов некроза, позволяет остановить гнойно-некротический процесс и снизить уровень интоксикации при инфицированом панкреонекрозе. К сожалению, доказательные данные отсутствуют и у международных экспертов нет единого мнения по вопросу оптимального способа дренирования очагов инфекции при панкреонекрозе [11].

Необходимо отметить, что технические возможности световой микроскопии, традиционная технология приготовления гистологических препаратов не позволяют оценить нативную структуру ткани. В настоящей работе впервые образцы парапанкреатической клетчатки, удаленной из гнойного очага у пациентов с панкреонекрозом, исследованы методом ОКТ. Существенно различающиеся оптические свойства паренхимы жировой ткани, соединительнотканной стромы и некротизированной ткани позволяют верифицировать их на ОКТ-изображении даже при визуальной оценке. Многочисленные адипоциты, наполненные жиром, и находящиеся между ними тяжи соединительнотканной стромы формируют ячеистые структуры и на ОКТ-изображениях имеют специфический рисунок из-за очень разной рассеивающей способности составляющих жировую ткань компонентов. Сопоставление ОКТ-изображений и морфологических данных позволяет поставить вопрос о перспективности применения метода ОКТ для прижизненного получения характеристик парапанкреатической клетчатки в фазе септической секвестрации гнойно-некротического парапанкреатита и о мониторинге эффективности его лечения.

На микроструктуру парапанкреатической жировой клетчатки гнойно-некротического очага активно воздействует способ дренирования. Перфузионно-аспирационное дренирование по сравнению с традиционным способом пассивного дренирования ассоциировано с меньшей долей некротизированной ткани (14,4% против 46,2%; p≤0,05) и большей долей сосудисто-стромального компонента (16,2% против 5,6%; p≤0,05). Метод оптической когерентной томографии позволяет качественно отличать паренхиму жизнеспособной жировой парапанкреатической клетчатки от участков некротизированной ткани и подтверждает данные, полученные при гистоморфометрии, о существенных различиях микроструктуры жировой клетчатки, изъятой из очага гнойно-некротического поражения после дренирования различными способами. Существенной особенностью при этом является возможность исследования структуры нативной (нефиксированной) жировой ткани.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — М.Г.Р., Н.Д.Г., В.М.Г.

Сбор и обработка материала — М.Г.Р., О.А.М, Е.Б.К, А.А.С., Е.Л.Б, Г. В.Г., Д.В.Ш.

Статистическая обработка — М.Г.Р., В.В.Б.

Написание текста — М.Г.Р., Е.Б.К., В.В.Б., О.А.М.

Редактирование — Н.Д.Г., В.М.Г.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Рябков Максим Георгиевич — e-mail: maxim-ryabkov@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-9555-190X