Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) при COVID-19 отличается худшим прогнозом по сравнению с ОРДС при других заболеваниях. Летальность от ОРДС при COVID-19 составляет 26,0—61,5%, а обусловленная другими причинами, — 35,3—37,2% [1].

Патогенез ОРДС, в том числе при COVID-19, недостаточно ясен ввиду сложного взаимодействия многих патогенетических факторов [2, 3]. Установлено, что воздействие на ткань легкого любого выраженного повреждающего фактора приводит к развитию во многом стереотипных патологических изменений альвеолярно-капиллярного комплекса [4]. Выявлено, что морфологическим субстратом такого клинического состояния, как ОРДС, является диффузное альвеолярное повреждение (ДАП), причем при COVID-19 его особенностями являются дисхрония и пролонгация фаз развития ДАП, вовлечение в патологический процесс сосудистого русла легких и развитие альвеолярно-геморрагического синдрома [5—9]. Изучение клеточного состава воспалительного инфильтрата в ткани легких в разные фазы ДАП при COVID-19 позволит улучшить понимание патогенеза новой коронавирусной инфекции и свойственного ей ОРДС, а также особенностей повреждения легких при других вирусных инфекциях.

Согласно классическим представлениям, принято различать две фазы ДАП: экссудативную (раннюю) и пролиферативную (позднюю). Ряд исследователей классифицируют исход ДАП как его третью фазу — фибротическую [5—10]. Темой дискуссии остается сопоставление клинических стадий ОРДС и морфологических фаз ДАП. В клинической классификации отмечают доклиническую стадию ОРДС, стадию обратимого острого повреждения легких и стадию прогрессирования, которые, вероятно, имеют в своей основе выделяемые морфологически соответственно раннюю и позднюю стадию экссудативной и, возможно, раннюю стадию пролиферативной фазы ДАП [11, 12].

Пусковым механизмом развития ДАП является выделение цитокинов и других биологически активных веществ различными клеточными популяциями альвеол и эндотелием сосудов, что активирует циркулирующие в крови полиморфно-ядерные лейкоциты (ПЯЛ), лимфоциты и моноциты/макрофаги (в том числе альвеолярные макрофаги, лимфоциты и гистиоциты межальвеолярных перегородок). Среди клеток воспалительного инфильтрата ведущее значение в развитии, течении и исходе ДАП принадлежит, как полагают, ПЯЛ, которые, по-видимому, вместе с макрофагами инициируют патологический процесс. Т-лимфоциты, как известно, запускают механизмы адаптивного иммунного ответа, а макрофаги способствуют, помимо инициации и регуляции иммунного ответа, главным образом резорбции экссудата, регенерации, организации и ремоделированию ткани легкого. Адгезия к эндотелию межальвеолярных капилляров и посткапиллярных венул, выход за пределы сосудистого русла, в том числе в просвет альвеол, интра- и экстравазальная дегрануляция и нетоз (апоптоз с формированием сети внеклеточных нитей ДНК) ПЯЛ приводят к повреждению всех компонентов альвеолярно-капиллярного комплекса, повышению проницаемости аэрогематического барьера, что влечет за собой выход белков плазмы и форменных элементов крови в межклеточное пространство и просвет альвеол. Белки плазмы крови, прежде всего фибрин, становятся основой для формирования интраальвеолярных (иногда и интрабронхиолярных) гиалиновых мембран. Важную роль в альтерации компонентов альвеолярно-капиллярного комплекса играют также лимфоциты и макрофаги [13—18]. Восстановление ткани легкого начинается уже в пролиферативной фазе ДАП. Характерны элиминация и организация экссудата, усиление воспалительной инфильтрации со сменой ее клеточного состава, пролиферация и плоскоклеточная метаплазия альвеолоцитов и эпителия бронхиол, а также фибробластов межальвеолярных перегородок, активация неоангиогенеза [10]. В исходе ДАП (фибротическая фаза) у части пациентов развиваются карнификация, интерстициальный фиброз легких и некоторые другие изменения [5—10, 17].

Цель исследования — определение соотношения ПЯЛ, лимфоцитов и макрофагов (соответственно CD15-, CD3- и CD68-позитивных клеток) в воспалительном инфильтрате ткани легких в разные фазы ДАП при COVID-19 на материале аутопсий.

Материал и методы

Изучены образцы ткани легких, полученные при 25 аутопсиях умерших от COVID-19. По результатам прижизненного вирусологического исследования назо- и орофарингеальных мазков методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) у 22 (88%) пациентов была подтверждена коронавирусная инфекция, вызванная вирусом SARS-CoV-2. При посмертном исследовании у всех умерших аналогичным методом ПЦР была подтверждена коронавирусная инфекция COVID-19. Наличие РНК-вируса SARS-CoV-2 в ткани легкого было установлено во всех наблюдениях на основании результатов ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в реальном времени из парафиновых гистологических блоков. Вторичная бактериальная или микотическая инфекция была исключена после посмертного бактериологического исследования мазка из ткани легкого и патогистологически. Возраст умерших 14 мужчин и 11 женщин составил от 41 года до 88 лет (медиана 63 года); длительность заболевания — от 5 до 44 сут (медиана 19 сут); продолжительность госпитализации — от 1 до 40 сут (медиана 14 сут). У 22 (88%) пациентов проводилась искусственная вентиляция легких продолжительностью от 1 до 40 сут (медиана 7 сут). У большей части умерших диагностированы коморбидные заболевания, среди которых наиболее часто встречались хронические формы ишемической болезни сердца (постинфарктный кардиосклероз и ишемическая кардиомиопатия — 24%), сахарный диабет 2-го типа (20%) и гипертоническая болезнь с поражением сердца и почек (12%) (табл. 1). В изученных наблюдениях отсутствовала танатологически значимая патология легких другой этиологии. Непосредственной причиной смерти всех больных явилась острая дыхательная недостаточность вследствие развития ОРДС.

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов

Примечание. * — медиана (минимум-максимум) для количественных переменных с нормальным распределением.

Патолого-анатомическое вскрытие проводили не позднее 24 ч после констатации биологической смерти пациентов. Изъятые от 4 до 6 фрагментов ткани легких фиксировали в забуференном 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 ч при температуре 4—5 °C, после чего рутинным методом с использованием заливки в парафин изготавливали серийные гистологические препараты, окрашенные гематоксилином и эозином. Патолого-анатомические исследования проводили, строго соблюдая принципы биобезопасности [19—22].

Для выполнения ОТ-ПЦР в реальном времени выделение РНК из парафиновых гистологических блоков проводили с помощью набора High Pure FFPET RNA Isolation Kit (Roche, Швейцария) согласно протоколу производителя. Выделение осуществляли из одиночных гистологических срезов толщиной 10 мкм, концентрацию полученных препаратов РНК измеряли, используя NanoDrop Lite (Thermo Fisher Scientific, США). Образцы РНК после выделения хранили при –70°C. ОТ-ПЦР в реальном времени проводили в амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). Результаты обрабатывали, используя программу CFX Manager (Bio-Rad Laboratories, США).

Иммуногистохимическое исследование проводили с помощью иммуностейнера Ventana BenchMark Ultra и антител к гранулоцитам CD15 (MMA), лимфоцитам CD3 (2GV6), макрофагам CD68 (KP-1). Для оценки соотношения между ПЯЛ, лимфоцитами и макрофагами использовали метод двойного (синхронного) иммуногистохимического окрашивания с определением экспрессии одновременно к парам маркеров CD3 и CD15; CD15 и CD68 с хромогенами красного и коричневого цветов.

Соотношение CD15-, CD3- и CD68-позитивных клеток в разные фазы ДАП рассчитывали как среднее арифметическое процентного соотношения CD15-, CD3- и CD68-позитивных клеток к общему количеству клеток воспалительного инфильтрата в 10 случайно отобранных полях зрения в 10 гистологических препаратах при увеличении микроскопа в 200 раз.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программного пакета Microsoft Excel-2020 для подсчета относительных величин и IBM^® SPSS Statistics для обработки абсолютных величин. Для установления значимости различий между несколькими группами по количественным признакам использовали критерий Краскела—Уоллиса с последующим применением критерия Манна—Уитни для апостериорного попарного сравнения.

Результаты

Морфологические признаки ДАП были выявлены у всех умерших от COVID-19. Воспалительный инфильтрат разной степени интенсивности был представлен неодинаковым количеством ПЯЛ, лимфоцитов, макрофагов и других клеток. Во всех наблюдениях в различных участках легких обнаружено сочетание стадий экссудативной и пролиферативной фаз ДАП.

Для экссудативной фазы ДАП (рис. 1, а), преобладавшей в 12 (48%) наблюдениях, были характерны интраальвеолярные отек и гиалиновые мембраны, отек межальвеолярных перегородок, альвеолярно-геморрагический синдром. В просвете альвеол наблюдались группы ПЯЛ. Микроангиопатия характеризовалась повреждением эндотелия, выраженным полнокровием, стазами и сладжами эритроцитов, множественными фибриновыми тромбами. Выявлена выраженная адгезия ПЯЛ к эндотелию микроциркуляторного сосудистого русла (феномен «краевого стояния»). Отмечалась слабовыраженная лейкоцитарная с примесью лимфоцитов и макрофагов воспалительная инфильтрация — периваскулярная, перибронхиальная и в межальвеолярных перегородках, характерная для ДАП [5—10, 23]. При иммуногистохимическом исследовании клеточный состав воспалительного инфильтрата и интраальвеолярного экссудата был представлен преимущественно ПЯЛ (CD15-позитивные клетки), которые составляли 56,8% от общего числа клеток инфильтрата, и в меньшей степени — CD3-позитивными клетками (6,9%) и CD68-позитивными клетками (19,5%) (рис. 1, б—г; табл. 2).

Рис. 1. Экссудативная фаза ДАП при COVID-19.

а — объяснение в тексте, окраска гематоксилином и эозином; б—г — преобладание в воспалительном инфильтрате и интраальвеолярном экссудате ПЯЛ (CD15-позитивных клеток), иммуногистохимическое исследование с антителами к CD3 (коричневый хромоген) и CD15 (красный хромоген). а, б — ×100, в, г — ×200.

Таблица 2. Количество CD3-, CD15- и CD68-позитивных клеток в воспалительном инфильтрате в разные стадии и фазы ДАП при COVID-19

Примечание. Me — медиана; R — размах; M — среднее арифметическое значение; * — результаты указаны в виде среднего арифметического от абсолютного количества CD3-, CD15-, CD68-позитивных клеток и других клеток воспалительного инфильтрата и процентного отношения к общему количеству клеток в инфильтрате в каждом наблюдении.

Для ранней стадии пролиферативной фазы ДАП (рис. 2, а), преобладавшей в 7 (28%) наблюдениях, по сравнению с экссудативной фазой были характерны уменьшение интраальвеолярного отека и кровоизлияний, преимущественно мононуклеарный воспалительный инфильтрат в межальвеолярных перегородках и периваскулярно, мукоидный отек межальвеолярных перегородок, гипертрофия и гиперплазия альвеолоцитов II типа, иногда с формированием уродливой формы многоядерных симпластов, появление фибробластов в просвете альвеол с начальными признаками карнификации. Сохранялась микроангиопатия с фибриновыми тромбами, но появлялись очаги неоангиогенеза. В воспалительном инфильтрате, который был более выраженным, а также интраальвеолярно уменьшалось число ПЯЛ и увеличивалось количество мононуклеарных клеток [5—10]. При иммуногистохимическом исследовании 38,7% клеток воспалительного инфильтрата и интраальвеолярного экссудата составляли CD3-позитивные клетки (лимфоциты); 14,1% — CD15-позитивные клетки (ПЯЛ) и 13,5% — CD68-позитивные клетки (макрофаги) (рис. 2, б—г; см. табл. 2).

Рис. 2. Ранняя стадия пролиферативной фазы ДАП при COVID-19.

а — объяснение в тексте; окраска гематоксилином и эозином; б—г — преобладание в воспалительном инфильтрате и интраальвеолярном экссудате лимфоцитов (CD3-позитивных клеток), иммуногистохимическое исследование с антителами к CD3 (коричневый хромоген) и CD15 (красный хромоген). а, б — ×100, в, г — ×200.

Для поздней стадии пролиферативной фазы ДАП (рис. 3, а), преобладавшей в 6 (24%) наблюдениях, были характерны проявления карнификации, множественные очаги слабовыраженного интерстициального фиброза легких, усиление воспалительной мононуклеарной инфильтрации периваскулярной, перибронхиальной и межальвеолярных перегородок [5—10, 17]. При иммуногистохимическом исследовании 14,5% клеток инфильтрата составляли CD3-позитивные клетки (лимфоциты); 11,3% — CD15-позитивные клетки (ПЯЛ) и 39,3% — CD68-позитивные клетки (макрофаги), большая часть которых локализовалась интраальвеолярно (рис. 3, б—г; см. табл. 2).

Рис. 3. Поздняя стадия пролиферативной фазы ДАП при COVID-19.

а — объяснение в тексте; окраска гематоксилином и эозином; б—г — преобладание в воспалительном инфильтрате и просвете альвеол макрофагов (CD68-позитивных клеток), иммуногистохимическое исследование с антителами к CD15 (коричневый хромоген) и CD68 (красный хромоген). а, б — ×100, в, г — ×200.

При статистическом анализе (табл. 3) тест Краскела—Уоллиса показал статистически значимые различия количества CD3-, CD15-, CD68-позитивных клеток (p=0,006; p=0,000; p=0,001 соответственно) при сравнении экссудативной и ранней стадии пролиферативной фазы ДАП; для CD68-позитивных клеток (p=0,004) при сравнении ранней и поздней стадии пролиферативной фазы ДАП; и для CD15-позитивных клеток (p=0,034) при сравнении экссудативной фазы ДАП и поздней стадии пролиферативной фазы ДАП. Динамика изменений других количественных показателей CD3-, CD15-, CD68-позитивных клеток, не указанных выше, при сравнении стадий и фаз ДАП была статистически недостоверна.

Таблица 3. Достоверность различия количества CD15-, CD3- и CD68-позитивных клеток воспалительного инфильтрата в разные стадии и фазы ДАП при COVID-19

Примечание. Использован критерий Краскела—Уоллиса, * — статистически значимое различие показателей.

Таким образом, определение экспрессии CD15 (ПЯЛ), CD3 (лимфоциты) и CD68 (макрофаги) выявило динамику изменения клеточного состава воспалительного инфильтрата в ткани легкого в разные стадии и фазы ДАП при COVID-19. В экссудативной фазе ДАП выявлено статистически значимое преобладание CD15-позитивных клеток по сравнению с ранней и поздней стадией пролиферативной фазы ДАП (p=0,000 и p=0,034 соответственно), что совпадает с относительными показателями содержания CD15-позитивных клеток (56,8% в экссудативной фазе против 14,1 и 11,3% в ранней и поздней стадии пролиферативной фазы соответственно). Также выявлено относительно небольшое содержание в воспалительном инфильтрате в экссудативной фазе ДАП CD3-позитивных лимфоцитов (6,9%) и CD68-позитивных клеток (19,5%). При ранней стадии пролиферативной фазы ДАП определялось статистически значимое изменение клеточного состава воспалительного инфильтрата в виде существенного уменьшения числа CD15-позитивных клеток (ПЯЛ) до 14,1% (p=0,000) относительно общего количества клеток воспалительного инфильтрата; увеличение CD3-позитивных клеток (лимфоцитов) с 6,9 до 38,7% (p=0,006). Несмотря на статистически значимое изменение при этом абсолютного количества CD68-позитивных клеток (макрофагов) (p=0,001) при сравнении относительных показателей выраженных изменений не выявлено. При поздней стадии пролиферативной фазы ДАП динамика по сравнению с ее ранней стадией изменения клеточного состава воспалительного инфильтрата была выражена меньше. Выявлено значимое (p=0,004) увеличение количества CD68-позитивных клеток (макрофагов) с 13,5 до 39,3% в относительных показателях, что морфологически коррелировало с ремоделированием гиалиновых мембран с развитием карнификации и интерстициального фиброза легкого. Несмотря на изменения относительных показателей содержания ПЯЛ и лимфоцитов (CD15- и CD3-позитивных клеток соответственно) с 14,1 до 11,3% и с 38,7 до 14,5%, динамика их изменений не была статистически достоверной.

Заключение

Количество ПЯЛ, лимфоцитов и макрофагов (CD15-, CD3- и CD68-позитивных клеток соответственно) в составе воспалительного инфильтрата в разные стадии и фазы ДАП при COVID-19 статистически различается. В экссудативной фазе преобладают ПЯЛ (CD15-позитивные клетки), что, вероятно, является пусковым механизмом развития ДАП и, возможно, определяет объем поражения легких и тяжесть течения ОРДС при COVID-19. Ранняя стадия пролиферативной фазы характеризуется превалированием лимфоцитов (CD3-позитивные клетки), что соответствует началу процессов пролиферации и репарации. При поздней стадии пролиферативной фазы ДАП закономерно выявлено преобладание макрофагов (CD68-позитивные клетки), что коррелирует с процессами организации в ткани легкого.

Полученные данные позволяют объективизировать морфологическую диагностику разных стадий и фаз ДАП при COVID-19 и могут быть полезны для понимания патогенеза ОРДС и разработки лечебно-диагностических мероприятий при различных вариантах течения COVID-19.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — В.Э. Родионов, А.М. Авдалян, И.Н. Тюрин, Д.Н. Проценко;

Сбор и обработка материала — В.Э. Родионов, Д.М. Коновалов, М.Л. Филипенко, И.П. Оскорбин, М.А. Корюков;

Статистическая обработка — Н.В. Борискин;

Написание текста — В.Э. Родионов;

Редактирование — А.М. Авдалян, О.В. Зайратьянц.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.