В настоящее время в комплекс обследования пациентов с инсультом входят лишь исследования уровней холестерина, триглицеридов, липопротеидов высокой и низкой плотности [1, 2], а также С-реактивного белка (СРБ), гомоцистеина и генетических полиморфизмов [3, 4], которые не позволяют адекватно прогнозировать риск инсульта [5, 6] и, следовательно, сохраняется неопределенность показаний к хирургическому лечению больных с умеренным стенозом сонной артерии (50—69%). Так, пациентам с недавними транзиторной ишемической атакой (ТИА) или ишемическим инсультом на фоне умеренного (50—69%) ипсилатерального стеноза внутренней сонной артерии (ВСА) каротидная эндартерэктомия (КЭА) рекомендуется индивидуально в зависимости от ряда факторов, таких как возраст, пол, сопутствующие заболевания и в случае, если риск периоперационной смертности составляет менее 6% [2, 7]. Тем не менее, умеренный (50—75%) стеноз сонной артерии может быть связан с риском инсульта как у пациентов с асимптомными стенозами (3,4%), так и у пациентов с симптомными стенозами ВСА (22,2%) [6] и ТИА (4,0% у пациентов с асимптомным каротидным стенозом) [8]. Прогрессирование умеренного стеноза может приводить к увеличению риска атеротромботического инсульта [9, 10]. Поиск и внедрение более чувствительных и специфичных маркеров риска атеротромботического инсульта и/или ТИА позволит индивидуализировать терапию и проводить целенаправленную профилактику инсульта, т. е. оптимизировать лечебную стратегию у данных пациентов.

В нашем исследовании формирование информативного диагностического алгоритма базировалось на выявлении комбинации биомаркеров, совокупность которых позволяла выявить несоответствие защитных и повреждающих факторов, приводящих к симптомной трансформации атеросклеротической бляшки, и, следовательно, определить пациентов с асимптомными стенозами ВСА, которым предпочтительно проведение хирургического вмешательства.

Целью исследования было изучение информативности лабораторных показателей (биомаркеров атеросклероза, маркеров повреждения головного мозга и маркеров эндогенной нейропротекции в сыворотке крови) у пациентов с тяжелым атеросклеротическим стенозом ВСА в прогнозе развития атеротромботического инсульта.

Проведено одинарное слепое срезовое исследование лабораторных биомаркеров атеросклероза, маркеров повреждения головного мозга и маркеров эндогенной нейропротекции у пациентов с атеросклеротическими стенозами ВСА 50—99% и у здоровых добровольцев без атеросклероза брахицефальных артерий (БЦА).

Методы маскировки: специалисты по лабораторной диагностике и по статистике не владели информацией о принадлежности биоматериалов пациента к одной из обследуемых групп.

Проведение данного исследования одобрено локальным этическим комитетом ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. Все пациенты подписывали информированное добровольное согласие.

Базы проведения исследования: кафедра неврологии и нейрохирургии, клиника неврологии, клиника факультетской хирургии, кафедра клинической лабораторной диагностики, лаборатория диагностики аутоиммунных заболеваний Научно-методического центра Минздрава России по молекулярной медицине ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова; клиника сердечно-сосудистой хирургии ФГБУ «НМЧЦ им. Н.И. Пирогова»; РСЦ для больных с ОНМК СПб ГБУЗ «Городская больница № 26». Исследование зарегистрировано на ClinicalTrials.gov (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02450721).

Группы пациентов (возраст от 50 до 80 лет):

1-я группа. Пациенты с одно- или двусторонним стенозом ВСА 50—99% в острейшем периоде ишемического атеротромботического острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) или ТИА (до 3 сут от сосудистого события до включения в исследование).

2-я группа. Пациенты со стабильным атеросклеротическим стенозом ВСА 50—99%, в том числе подгруппа пациентов с «асимптомными» стенозами ВСА, не имеющих в анамнезе ОНМК и/или клинических проявлений, соответствующих ипсилатеральному стенозу бассейна мозгового кровообращения, и подгруппа пациентов с «симптомными» стенозами, в том числе перенесших ОНМК или имеющих резидуальный неврологический дефицит (последствия симптомных и «немых инсультов») или ТИА в сроки более 30 дней до включения в исследование.

3-я группа. Здоровые добровольцы без критериев невключения, не имеющие атеросклероза ВСА (комплекс интима—медиа менее 1,0 мм), без инсультов и ТИА в анамнезе.

Критерии невключения: факторы риска неатеротромботического инсульта в соответствии с критериями TOAST [29], злокачественное онкологическое заболевание, декомпенсированные хронические заболевания, инфекции, острые заболевания сердечно-сосудистой системы (чтобы свести к минимуму искажающий эффект временного повышения биомаркеров на фоне ишемического события), серьезная операция в течение 1 мес до включения в исследование, применение ноотропных препаратов в течение 1 нед до включения в исследование.

Объем обследования всех пациентов: сбор анамнеза, оценка неврологического статуса, нейровизуализация (магнитно-резонансная томография (МРТ) и/или мультисрезовая компьютерная томография (МСКТ) головного мозга, дуплексное сканирование БЦА, электрокардиография (ЭКГ) в 12 отведениях, рентгенография органов грудной клетки, холтеровское мониторирование ЭКГ, трансторакальная эхокардиография, клинический и биохимический анализ крови, коагулограмма, общий анализ мочи. Степень стеноза 50% и более определялась с помощью дуплексного сканирования БЦА (ультразвуковой сканер General Electric Vivid S6).

Выбор биомаркеров базировался на патофизиологических механизмах атеротромботического инсульта: биомаркеры атеросклероза (липопротеидассоциированная фосфолипаза А2 (Лп-ФЛА2), высокочувствительный СРБ (вчСРБ), липопротеин (а), ассоциированный с беременностью плазменный белок, А (PAPP-А), асимметричный диметиларгинин (АДМА) и другие биомаркеры), биомаркеры повреждения головного мозга (фосфорилированный нейрофиламент Н (PNF-H) и глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP)) и биомаркеры эндогенной нейропротекции (инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), инсулиноподобный фактор роста-2 (IGF-2), белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста-3 (IGFBP-3), эритропоэтин (ЕРО), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), нейротрофический фактор мозга (BDNF), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF)).

Забор венозной крови производили натощак с 7 до 9 часов утра из локтевой вены. Образцы сыворотки центрифугировали при 2000 g (при 20 °C в течение 10 мин), аликвоты хранили при –20 °С. Сывороточный уровень биомаркеров измеряли методом иммуноферментного анализа на микропланшетном ридере Bio-Tek (США) с использованием следующих наборов: Lp-PL-A2 ELISA-Kit («Cloud-Clone Corp.», США); PAPP-A ELISA-Kit («IBL», Германия); Lp (a) ELISA-Kit («AssayPro», США), ADMA ELISA-Kit («ImmunDiagnostik», Германия); hsCRP ELISA-Kit («Biomerica», Германия); EPO ELISA-Kit («Biomerica, Inc.», США); CNTF ELISA-Kit («R&D Systems», США, Canada); BDNF ELISA-Kit («R&D Systems», США, Canada); IGF-I ELISA-Kit («Immunodiagnostic systems», Int.); IGF-II ELISA («Mediagnost», Германия); IGFBP-3 ELISA-Kit («Mediagnost», Германия); GFAP ELISA-Kit («BioVendor», Int.); pNF-H ELISA-Kit («BioVendor», Int.).

Статистический анализ данных производили с помощью пакета SPSS (версия 12). С учетом небольшого размера выборки и ненормального распределения статистическую обработку результатов производили с использованием непараметрических критериев Манна—Уитни для двух независимых выборок и Крускалла—Уоллиса для трех независимых выборок и более. Описательная статистика в статье дана в виде медианы и квартилей: медиана [25-й; 75-й процентиль]. Для обнаружения новых знаний в базе данных также применялся метод компьютерного моделирования — технология «добычи данных» (дерево решений) с помощью программы Rapid Miner (интеллектуальный анализ данных). Все тесты были двусторонними, а уровень значимости был определен как р<0,05.

Обследованы 356 больных: распределение пациентов по группам приведено в табл. 1.

Уровни АДМА (рис. 1) и вчСРБ (рис. 2) в сыворотке крови были значительно выше в группе острого инсульта, чем в группе стабильных стенозов и группе здоровых добровольцев. При этом концентрация PNF-Н в группе стабильных стенозов была значительно меньше, чем в контрольной группе и группе пациентов с острым инсультом. Не было существенного различия в уровне PNF-Н между 1-й и 2-й группами (рис. 3).

Концентрация CNTF в сыворотке крови была значительно выше у пациентов со стабильными стенозами ВСА и во время острой фазы атеротромботического инсульта по сравнению со здоровыми добровольцами (рис. 4). В табл. 2 показано распределение факторов риска развития инсульта в группах. Уровень IGFBP-3 продемонстрировал отчетливо меньшие значения во 2-й группе по сравнению с группой контроля (табл. 3).

При сравнении уровня IGFBP-3 и ИФР-1 в подгруппах пациентов с «симптомными» и «асимптомными» стенозами ВСА выявлены достоверные отличия (рис. 5, 6). При этом концентрация IGF-2 не отличалась в подгруппах пациентов с симптомными и асимптомными стенозами (р=0,0554).

При сравнении других биомаркеров атеросклероза (ЛП ФЛА 2, липидный профиль крови и липопротеин (а)) и биомаркеров «эндогенный нейропротекции» (эритропоэтин, GCSF и BDNF) в сыворотке крови не было найдено статистически значимых различий между группами.

Используя метод интеллектуального анализа данных, мы разработали экспертную систему, в которой в качестве класса для технологии «добычи данных» были выбраны следующие критерии: наличие сосудистого события в анамнезе; резидуальный неврологический дефицит; симптомность стеноза без учета «острый» или «не острый» инсульт; показания к хирургическому лечению; сывороточная концентрация вчСРБ (1-я группа — вчСРБ ≥2 мг/л; 2-я группа 2 — вчСРБ <2 мг/л); стабильность атеросклеротической бляшки по данным дуплексного сканирования. На основании проведенного анализа для асимптомных стенозов ВСА по сравнению с симптомными стенозами справедливо правило: сывороточная концентрация, А (PAPP-A) мкг/мл ≤0,326; сывороточная концентрация PNF-H пг/мл ≤94,528 (точность классификатора согласно кросс-валидации составила 85,00±13,92%). Не удалось построить систему с точностью более чем 80% классификатора для других критериев, что обусловлено небольшим размером выборки.

В оценке информативности «новых» биомаркеров атеросклероза некоторые исследования показали, что они связаны с эрозией, разрывом и тромбозом атеросклеротической каротидной бляшки и могут быть вовлечены в ее симптомную трансформацию [6, 9, 11—16, 25], хотя результаты ряда других исследований были противоположными [6, 11, 13, 17—26]. Мы предполагаем, что высокие сывороточные концентрации АДМА и вчСРБ могут быть связаны с нестабильностью атеросклеротической бляшки, ведущей к атеротромботическим событиям. PNF-Н и GFAP можно рассматривать как маркеры повреждения нервной ткани. Их уровень увеличивается во время острой или хронической ишемии. GFAP является одним из самых ранних биомаркеров ишемического инсульта [27]. Наши данные о снижении сывороточного уровня PNF-H у больных со стабильными стенозами по сравнению с группой здоровых добровольцев и группы атеротромботического инсульта мы рассматриваем в качестве защитной реакции у пациентов со значительным, но стабильном стенозом ВСА.

Систему инсулиноподобного фактора роста можно считать одним из самых перспективных маркеров эндогенной нейропротекции. Так, было показано, что низкие концентрации ИФР-1 и -2 связаны с высоким сердечно-сосудистым риском (инсульт и инфаркт миокарда) [28]. Таким образом, высокие концентрации инсулиноподобного фактора роста ввиду нейропротективных свойств обеспечивает защиту головного мозга даже у пациентов со значительным риском сосудистых осложнений (например, со значимыми стенозами сонных артерий). При этом мы считаем, что снижение IGFBP-3 и IGF-1 в сыворотке крови является проявлением дисфункции системы эндогенной защиты, что в свою очередь может привести к инсульту и/или прогрессированию атеросклеротических бляшек и эндотелиальной дисфункции.

Высокий уровень CNTF у пациентов со стабильными стенозами ВСА и пациентов с инсультами по сравнению со здоровыми добровольцами мы рассматриваем как проявление защиты на повреждение мозга, вызванного стенозом или ишемическим инсультом, т. е. как маркер активации эндогенной нейропротекции. Полученные нами данные о сывороточных уровнях PAPP-A и PNF-Н у пациентов с асимптомными и симптомными стенозами ВСА требуют проведения дальнейших проспективных исследований для верификации риска атеротромботического инсульта.

Повышение концентраций биомаркеров атеросклероза (ADMA, вчСРБ и PAPP-A) в сочетании со снижением сывороточных уровней маркеров эндогенной нейропротекции (IGF-1 и IGFBP-3) можно рассматривать как факторы, приводящие к дестабилизации атеросклеротической бляшки и повышению риска атеротромботического инсульта у пациентов со стенозами ВСА. Иначе говоря, измерение вчСРБ, АДМА, PAPP-A, PNF-Н, IGF-1, IGFBP-3 и CTNF в сыворотке крови больных со стенозами ВСА может быть полезным при выявлении асимптомных пациентов высокого риска атеротромботического инсульта, которые выиграют от хирургического лечения.

1. Сывороточные уровни АДМА и вчСРБ значительно увеличиваются во время острой фазы атеротромботического инсульта. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы исследовать потенциальную роль ADMA и вчСРБ как скрининга нестабильности атеросклеротической бляшки и риска инсульта у пациентов со стенозами ВСА.

2. Низкие концентрации IGF-1 и IGFBP-3 у пациентов со стенозами ВСА могут быть рассмотрены как дополнительные факторы риска инсульта.

3. Отмечается снижение уровня PNF-Н и увеличение уровня СТЕА у больных со стенозами ВСА во время острой фазы атеротромботического инсульта.

4. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы уточнить, связаны ли уровни PAPP-A ≥0,326  мкг/мл и PNF-Н ≥94,528 пг/мл с нестабильностью атеросклеротической бляшки и симптомной трансформацией атеросклеротической бляшки.

Благодарность. За помощь в подготовке и проведении данного исследования авторы выражают глубокую благодарность к.б.н., руководителю отдела фармакоэпидемиологии и биомедицинской статистики Института фармакологии им. А.В. Вальдмана ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова Вербицкой Елене Владимировне, ведущему научному сотруднику НИЦ, д.м.н. Токаревич Кире Константиновне, профессору кафедры факультетской хирургии ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, д.м.н. Вавилову Валерию Николаевичу и ведущему научному сотруднику, д.м.н. Лапиной Валентине Михайловне.

Конфликт интересов отсутствует.

Источник финансирования: госзаказ по НИР ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.