Применение онколитических вирусов является одним из перспективных инновационных подходов к терапии опухолей, в частности, к терапии глиобластом, которые представляют собой агрессивные первичные опухоли головного мозга человека с крайне неблагоприятным прогнозом [1, 2]. Обнадеживающие результаты в I—II фазе клинических испытаний показал препарат ParvOryx, созданный на основе парвовируса H1 [3]. По результатам доклинических испытаний этого препарата до 80% животных с глиомой С6 после локального, системного или интраназального лечения препаратом ParvOryx полностью выздоравливали [4].

Еще одним фаворитом среди онколитических вирусов является вирус осповакцины (VACV) [5]. Онколитический потенциал VACV зависит от штамма вируса [6]. Высоковирулентные штаммы, такие как Western Reserve, демонстрируют больший онколитический эффект [7], но их использование в терапевтических целях может привести к развитию осложнений, связанных с вирусной инфекцией. Мы в своей работе используем средний по вирулентности российский штамм Л-ИВП, который широко применялся для вакцинации населения против натуральной оспы и обладает высокой природной онкоселективностью [8]. Штамм Л-ИВП является репликативно-компетентным в отношении клеток человека, поэтому существующий риск развития осложнений при использовании данного штамма для противоопухолевой терапии определяет необходимость его аттенуации (ослабления). Аттенуация может быть достигнута удалением одного или нескольких генов факторов вирулентности VACV, в частности, гена вирусного ростового фактора (VGF) [9].

Перспективным считается подход к созданию онколитических вариантов VACV, основанный на использовании высокоаттенуированных штаммов в качестве вектора для доставки противоопухолевых белков, адресно усиливающих их литические свойства [7]. Наиболее известным среди таких штаммов является MVA (modified vaccinia virus Ankara) [10]. Штамм MVA способен реплицироваться в культурах клеток птиц, но является репликативно-некомпетентным для нормальных клеток млекопитающих, однако малигнизация последних способствует повышению их чувствительности к MVA [11]. Показано также, что при вакцинации экспериментальных животных или людей рекомбинантными вариантами MVA наблюдается эффективная экспрессия чужеродных белков, гены которых встроены в вирусный геном [12].

Мы в своей работе решили объединить онколитический потенциал парвовируса Н-1 и аттенуированных штаммов VACV в отношении глиобластомы человека. При доклиническом исследовании ParvOryx было показано, что главным фактором, ответственным за онколитическую активность парвовирусов, является белок NS1 (первый неструктурный белок парвовируса H-1), причем опухолевые клетки мозга оказались особенно уязвимы к его прямому цитотоксическому действию [13].

Рекомбинантные штаммы Л-ИВП и MVA в настоящее время используют для создания противоопухолевых препаратов [14], однако данных прямого сравнения их противоопухолевого действия не опубликовано. Целью настоящего исследования являлось сравнение противоопухолевого эффекта рекомбинантных штаммов VACV Л-ИВП и MVA, имеющих одинаковую встройку трансгена онкотоксического белка NS1 парвовируса H-1. В качестве модели для оценки онколитической активности рекомбинантных штаммов Л-ИВП и MVA мы использовали клетки глио-бластомы человека в экспериментах in vitro и in vivo.

Вирусы и культуры клеток. Штаммы MVA (GenBank, AY603355.1) и Л-ИВП (GenBank, KP233807) получены из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (Кольцово, Новосибирская обл.). Рекомбинантный штамм VVdGF2/6 был получен нами ранее [9].

Для культивирования исходного и рекомбинантных штаммов Л-ИВП использовали клетки почки африканской зеленой мартышки CV-1. Для культивирования исходного и рекомбинантного штаммов MVA использовали линию клеток CER, являющуюся гибридом клеток сирийского хомячка BHK-21 и куриных фибробластов. Линии клеток CV-1 и CER получены из Коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Культура клеток глио-бластомы человека U87MG получена из коллекции АТСС. Клетки выращивали в ростовой среде ДМЕМ («Invitrogen», США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) («HyClone», США) при температуре 37 °C.

Титр вируса определяли методом бляшек на монослое клеток CV-1 (для штамма Л-ИВП) или CER (для штамма MVA), окрашенном фиксирующим раствором кристаллического фиолетового (2 г/л кристаллический фиолетовый, 50 мл/л формальдегид, 100 мл/л этанол, вода). Титр выражали в числе бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл суспензии.

Конструирование инсерционных плазмид. Ген NS1 парвовируса Н-1 получен синтетическим путем в соответствии со структурой, представленной в GenBank под номером X01457.1, позиции нуклеотидов 264—2280. К С-концу гена NS1 была добавлена последовательность, кодирующая эпитоп FLAG с мотивом DYKDDDDK, для иммунодетекции синтезируемого NS1 с помощью коммерческих антител. Ген NS1 был клонирован в плазмиду pGEM-Puro-UN-DS [9] под контроль ранне-позднего синтетического промотора РE/L VACV c получением плазмиды pGEM-Puro-NS1-Flag. Эта плазмида использована для встройки гена NS1 и одновременной делеции гена VGF штамма Л-ИВП ВОВ.

Для получения рекомбинантных вариантов штамма MVA нами была сконструирована плазмида pDel2-Pat. В качестве базовой была использована плазмидная ДНК pGEM-4Z (Promega, P2161), в которую были встроены фрагменты генома MVA, фланкирующие делецию II (Del II) [15]. Фрагмент длиной 568 н.п. (GenBank AY603355.1, позиции нуклеотидов 14928—15495) был получен методом ПЦР на матрице ДНК штамма MVA и встроен в pGEM-4Z по KpnI—EcoRI сайтам. Далее в эту же плазмиду был встроен фрагмент генома MVA, расположенный слева от Del II длиной 695 пар нуклеотидов (GenBank AY603355.1, позиции нуклеотидов 14182—14876) по сайтам SphI—PstI.

На следующем этапе в сконструированную ДНК был введен ген устойчивости к пуромицину pat под контролем промотора VACV по NarI сайту c получением плазмиды pDel2-Pat. Оперон, кодирующий промотор и ген pat, получен из плазмиды pVGF-PE/L-Pat [16] путем обработки плазмидной ДНК рестриктазой ClaI, имеющей аналогичные липкие концы с NarI. На основе плазмиды pDel2-Pat была сконструирована инсерционная плазмида pDel2-NSI-Flag-Pat путем встройки по XmaI сайту оперона, состоящего из гена NS1 под контролем РE/L VACV. Оперон был получен методом ПЦР с использованием в качестве матрицы ДНК плазмиды pGEM-Puro-NS1-Flag (см выше) и пары праймеров 32_U и 34_L с заложенными в них сайтами рестрикции XmaI (выделены подчеркиванием):

32_U — 5’-ATCGGCCCGGGAAACACACACTGAGGCCAAAA-3’,

34_L — 5’-ATCGGCCCGGGTTACTTATCGTCGTCGTCCTTGT-3’.

Инсерционная плазмида pDel2-NSI-Flag-Pat позволяет проводить встройку гена NS1 в район Del II штамма MVA.

Конструирование рекомбинантных вирусов. Рекомбинантные варианты штаммов Л-ИВП и MVA со встройкой трансгена NS1 получали методом временно́й доминантной селекции с использованием в качестве маркера гена устойчивости к пуромицину [9] и инсерционных плазмид pGEM-Puro-NS1-Flag и pDel2-NSI-Flag-Pat. Вирус клонировали методом бляшек под твердым агаровым покрытием и анализировали на наличие встройки трансгена NS1 методом ПЦР. Для детекции рекомбинантов штамма Л-ИВП использовали праймеры, фланкирующие ген VGF слева и справа на геноме вируса: Up35 5’-gtaagcaaagaatataagaatgaagcggtaatgat и Apa-L22 5’-cgagcacaataccgggagatgg [16]. Размер амплифицированного фрагмента ДНК исходного штамма Л-ИВП составлял 583 п.н., рекомбинантного варианта с делецией гена VGF и встройкой трансгена NS1 VV-NS1-dGF — 2456 п.н. Для детекции рекомбинантов штамма MVA использовали праймеры, специфичные к районам генома, фланкирующим Del II: MVA_F1 5’-CATGCTACTACCTTCGGGTAAA и MVA_R7 5’-TGCGTCTAGTATGTACGTTGTT. Размер амплифицированного фрагмента исходного штамма MVA составлял 285 п.н., рекомбинантного варианта со встройкой трансгена NS1 в районе делеции II MVA-NS1 — 2600 п.н. Отобранные рекомбинантные варианты дважды реклонировали, чтобы избежать следовых примесей исходного вируса. Структуру районов встройки вирусного генома подтверждали секвенированием. Готовые рекомбинантные штаммы VV-NS1-dGF и MVA-NS1 с титром 10^8—9 БОЕ/мл хранили в расфасованном виде при –80 °С до использования.

Анализ экспрессии трансгена NS1 в составе рекомбинантных VACV. Детекцию белка NS1 в клетках U87MG, инфицированных рекомбинантными VACV, анализировали методом Вестерн-блоттинга с использованием в качестве первичных антител ANTI-FLAG BioM2 («Sigma-Aldrich», США) как описано в [9].

Оценка онколитической активности рекомбинантных вирусов в культуре клеток U87MG. Онколитическую активность рекомбинантных вариантов VACV определяли микрометодом на 96-луночных планшетах («Greiner», США) с использованием 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфо-фенил)-2H-тетразолий-5-карбоксанилидa (реагент XTT, «Sigma-Aldrich», США), как описано в [9]. Онколитическую активность выражали как 50% цитотоксическую дозу (ЦТД₅₀) — концентрацию вируса, вызывающую гибель 50% клеток. Чем выше ЦТД₅₀, тем ниже онколитическая активность вируса.

Эксперименты in vivo. Исследование подкожных ксенотрансплантатов клеток U87MG проводили на самках мышей линии Nu/Nu в возрасте 6—7 нед. С этой целью мышам вводили суспензию клеток U87MG (1,0·10⁸ клеток/мл) в 0,9% NaCl, предварительно смешанную с ледяным Matrigel («BD Bioscience», США) в соотношении 2:1, в объеме 100 мкл подкожно в правый бок мыши ближе к бедру. Время формирования опухолей (ксенографтов) составляло 11 дней, когда объем опухолей достигал 80—120 мкл. Мышей со сформировавшимися опухолями (n=60) разделили на три равные группы. Животным первых двух групп однократно подкожно в область опухоли вводили рекомбинантные вирусы в дозе 10⁷ БОЕ/мл в 100 мкл стерильного 0,9% NaCl. Мышам контрольной группы аналогично вводили 100 мкл 0,9% NaCl. Мониторинг состояния мышей осуществляли 2 раза в неделю, объем опухоли рассчитывали по формуле L×W²×0,5 [17]. Общий период наблюдения после введения вируса составил 24 дня.

Для анализа репродукции вируса в органах мышей на 2, 5, 10, 15 и 24-е сутки после введения вируса животных умерщвляли (по 2 мыши в каждой экспериментальной группе) и забирали селезенку, печень, легкие, почки и кровь. 10% гомогенаты органов и тканей (v/v) готовили в 0,9% растворе NaCl, обрабатывали ультразвуком, осветляли центрифугированием и титровали методом бляшек на монослое клеток CV-1 (для VV-NS1-dGF) и CER (для MVA-NS1). Титр вируса в органах мышей выражали в количестве БОЕ на мл 10% гомогената соответствующего органа или ткани.

Исследование ортотопических ксенотрансплантатов клеток U87MG проводили на самцах мышей линии SCID (SHO-PrkdcscidHrhr). Перед операцией по ортотопической ксенотрансплантации клеток U87MG каждое животное помещали в камеру с протоком воздуха 350—400 мл/мин и 1,5% концентрацией изофлюрана. Через 3 мин животное переносили на подогреваемый операционный столик с температурой поверхности 37 °C и помещали под наркозную маску с 1,5% изофлюрана. Суспензию клеток вводили при помощи шприца Hamilton в подкорковые структуры мозга через отверстие в черепной коробке животного. Для этого на голове в каудально-краниальном направлении делали надрез кожи 3—4 мм длиной в районе брегмы и через отверстие в черепной коробке вводили 5 мкл суспензии клеток (500 тыс. клеток на одно животное). Динамику роста опухолей исследовали с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) на томографе BioSpec 117/16 USR («Bruker», Германия) — 11,7 Тесла. Всего в эксперименте было использовано 19 животных. На 24, 27 и 30-е сутки после внутримозгового введения клеток глиобластомы человека U87MG мышам вводили внутривенно (в ретроорбитальный синус) вирусы в дозе 10⁷ БОЕ/мл в 50 мкл стерильного 0,9% NaCl. Мышам контрольной группы аналогично вводили 50 мкл 0,9% NaCl. Каждая группа, включая контроль, состояла из 6—7 животных. Первое МРТ исследование головного мозга мышей было выполнено на 21-е сутки после инокуляции клеток U87MG, и далее проводили МРТ-оценку размеров опухоли каждые 5—7 дней. Размер опухоли высчитывали с помощью пакета программ Paravision 5.0, основываясь на разнице в контрасте между окружающими тканями и опухолью.

Статистический анализ. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием статистического пакета Statistica 10. Все значения выражали как среднее ±SE. Различия между средними значениями объема опухоли у животных из разных групп оценивали непараметрическим критерием Манна—Уитни (Mann—Whitney U-test).

Структура рекомбинантных вариантов представлена на рис. 1, а.

Экспрессию трансгена NS1 в составе рекомбинантов анализировали методом Вестерн-блот с использованием коммерческих антител на эпитоп FLAG, введенный в С-конец рекомбинантного белка (см. Материалы и методы). Результаты эксперимента представлены на рис. 1, с, из которого следует, что в лизатах клеток, инфицированных рекомбинантными вариантами VV-NS1-dGF и MVA-NS1, выявляется белок с молекулярной массой 100 кДа, который позитивно реагирует с антителами к эпитопу FLAG. Размер транскрипта, включающего последовательность гена NS1 и эпитопа FLAG, составляет 2163 п.н. Расчетная молекулярная масса полипептида составляет 75—80 кДа. По данным литературы, в инфицированных парвовирусом Н-1 клетках регистрируется 2 формы белка NS1 — с молекулярной массой 84 и 100 кДа [18]. Увеличение молекулярной массы обусловливается разной степенью фосфорилирования белка. Таким образом, сконструированные нами рекомбинантные штаммы VACV экспрессируют белок NS1 в форме, наиболее близкой к его природной полноразмерной модификации.

На рис. 2 представлены

На первом этапе оценку противоопухолевой активности рекомбинантных вариантов VACV проводили на модели подкожных ксенографтов глиобластомы человека U87MG, привитых мышам линии Nu/Nu. Как следует из рис. 3, в

Метод биотитрования выявил присутствие обоих штаммов VACV в крови мышей (10^2—3 БОЕ/мл) через 2 сут после введения, что указывает на возможность системного распространения вируса по организму и достижения метастазов, отдаленных от места прививки опухолей [19]. Рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF регистрируется в органах мышей (титр ≤10⁴ БОЕ/мл) через 5—10 сут после его введения в опухоль, аналогично исходному штамму Л-ИВП [8] и аттенуированным вариантам на его основе [19]. Рекомбинантный штамм MVA-NS1 не выявлен во внутренних органах мышей, что говорит о большем снижении его инфекционности по сравнению со штаммом VV-NS1-dGF. При этом оба рекомбинантных штамма в высоком титре детектируются в гомогенатах ксенографтов U87MG. Максимальный титр штамма VV-NS1-dGF составляет 10⁸ БОЕ/мл 10% гомогената опухоли и отмечается в ксенографтах через 15 сут после введения вируса, тогда как максимальный титр штамма MVA-NS1 на порядок меньше — 10⁷ БОЕ/мл 10% гомогената опухоли и отмечается лишь через 24 сут.

Ранее авторами была показана возможность ортотопической ксенотрансплантации клеток U87MG мышам линии SCID [20]. Эта модель более приближена к клинической картине заболевания, чем подкожные ксенотрансплантаты клеток U87MG, описанные выше. Вирус вводили внутривенно трехкратно с интервалом 3 дня, начиная с 24-х суток после инокуляции клеток. В эксперимент были отобраны животные с детектируемыми опухолями объемом 5 мкл и более. Наличие опухолей и их размер контролировали с применением МРТ. Результаты представлены на рис. 4.

Как следует из рис. 4, а, время жизни мышей, леченных штаммом MVA-NS1, не увеличивается по сравнению с контролем. Мыши этих обеих групп погибают к 51-му дню эксперимента. В то же время в группе мышей, леченных штаммом VV-NS1-dGF, 33% животных оставались живы на 51-е сутки. МРТ головного мозга этих мышей показала практически полное торможение роста опухоли к этому времени. Одно животное из этой группы прожило более 90 сут и было выведено из эксперимента эвтаназией на 96-е сутки после его начала. На рис. 4, б показаны значения объема опухолей мозга у мышей, выживших через 36 сут после инокуляции клеток U87MG, когда в контрольной группе гибель составила более 50%. Как следует из этого рисунка, объем глиобластом у мышей, леченных штаммом VV-NS1-dGF, значимо отличается от контроля (p=0,037). Лечение глиобластомы штаммом MVA-NS1 не приводило к значимому эффекту (см. рис. 4).

Синтетический ген NS1 парвовируса крыс Н-1 был использован нами в качестве трансгена для встройки в геном двух аттенуированных штаммов VACV, VV-NS1-dGF и MVA-NS1, с целью усиления их противоопухолевой активности. Рекомбинант VV-NS1-dGF сконструирован на основе репликативно-компетентного для клеток млекопитающих штамма Л-ИВП, имеет делецию гена VGF (фактор вирулентности) и на месте этой делеции — встройку трансгена белка NS1. В качестве исходного для конструирования рекомбинанта MVA-NS1 был взят высокоаттенуированный репликативно-некомпетентный для клеток млекопитающих штамм MVA, в геном которого в район делеции II мы встроили аналогичный трансген белка NS1. Оба рекомбинантных штамма VACV эффективно продуцируют NS1 в клетках глиобластомы человека U87MG. Молекулярная масса рекомбинантного белка NS1 составляет 100 кДа, что соответствует форме, наиболее близкой к его природной полноразмерной модификации. Такая модификация позволяет сохранить многочисленные и разно-образные онкотоксические активности белка [18, 21].

Встройка трансгена NS1 значимо усиливает литическую активность VACV в отношении клеток глиобластомы человека U87MG in vitro. При этом литическая активность вариантов штамма MVA (MVA-NS1 и контроль MVA) не отличалась от соответствующих показателей вариантов вирусов на основе более вирулентного штамма Л-ИВП (VV-NS1-dGF и контроль VVdGF2/6). Это для нас явилось неожиданностью, потому что известна отрицательная связь между аттенуацией VACV и его онколитической активностью — чем больше аттенуация вируса, тем меньше его онколитическая активность [6]. Очевидно, что клетки U87MG являются высокочувствительными для штамма MVA и, в отличие от нормальных клеток млекопитающих, могут эффективно поддерживать его репликацию. Однако в экспериментах in vivo, где U87MG клетки представлены не в виде хорошо доступного для вируса монослоя, а в виде опухолеподобных ксенографтов с многослойной плотной массой клеток, были выявлены существенные отличия между штаммами MVA-NS1 и VV-NS1-dGF.

Рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF более эффективно разрушает подкожные ксенографты клеток U87MG у мышей линии Nu/Nu по сравнению со штаммом MVA-NS1 при однократном введении вирусов в район опухоли. Оба штамма избирательно размножаются в опухолевых клетках, однако репликативная активность штамма VV-NS1-dGF выше, что обеспечивает его быстрое накопление в ксенографтах и их последующую деструкцию.

Исследование противоопухолевых свойств рекомбинантных штаммов в ортотопической модели установившейся глиобластомы U87MG продемонстрировало увеличение продолжительности жизни мышей и значимое уменьшение объема опухолей при лечении штаммом VV-NS1-dGF. Виротерапию проводили, начиная с 21-х суток после прививки клеток U87MG, и только для мышей с установившимися ксенотрансплантатами, средний объем которых к этому времени составлял 5,7 мкл. Такой подход моделирует опухоли мозга человека достаточно поздних стадий, на которых чаще всего заболевание и выявляется. Важно отметить, что в данном случае использовалось системное введение вируса, что наиболее предпочтительно для терапии труднодоступных опухолей мозга. Считается, что VACV вследствие своего большого размера не преодолевает гематоэнцефалический барьер [22], однако аномальная структура и повышенная проницаемость сосудов опухолей [23] снимают эти ограничения и обеспечивают дополнительную онкоселективность вируса.

Проведенные исследования показали, что рекомбинант VV-NS1-dGF, сконструированный на основе репликативно-компетентного штамма вируса осповакцины Л-ИВП, обладает более высоким противоопухолевым потенциалом в сравнении с рекомбинантом MVA-NS1, сконструированным на основе репликативно-некомпетентного штамма MVA, и может рассматриваться в качестве перспективного препарата для лечения опухолей мозга человека.

Исследования выполнены с использованием оборудования ЦКП «Центр генетических ресурсов лабораторных животных» ФИЦ ИЦиГ СО РАН.

The studies are implemented using the equipment of the Center for Genetic Resources of Laboratory Animals at ICG SB RAS.

Работа с лабораторными животными проводилась при поддержке Министерства образования и науки России (Уникальный идентификатор проекта RFMEFI62117X0015). Работа по конструированию рекомбинантных вирусов проведена с использованием средств гранта РФФИ № 18−29−09044/18.

The work with laboratory animals was supported by the Ministry of Education and Science of Russia (Unique identifier of the project RFMEFI62117X0015). The work on the construction of recombinant viruses was carried out using the grant of the Russian Foundation for Basic Research No. 18−29−09044/18.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Для проведения экспериментов использовали иммунодефицитных мышей. Животных содержали в ЦКП «SPF-виварий» Института цитологии и генетики СО РАН. Эксперименты были выполнены с соблюдением принципов гуманности в соответствии с директивой Европейского сообщества (86/609/ЕЕС).

The authors declare no conflicts of interest.

In this study, we used immunodeficient mice. The animals were kept at the SPF-Vivarium Joint Use center of the Institute of Cytology and Genetics, Russian Academy of Sciences. All animal experiments were carried out in compliance with the protocols and recommendations for the proper use and care of laboratory animals (ECC Directive 86/609/EEC).

Сведения об авторах

Ткачева А.В. — https://orcid.org/0000-0001-7767-0537

Сиволобова Г.Ф. — https://orcid.org/0000-0002-8362-0314

Гражданцева А.А. — https://orcid.org/0000-0001-7712-3699

Шевелев О.Б. — https://orcid.org/0000-0003-3200-958X

Разумов И.А. — https://orcid.org/0000-0002-6756-1457

Завьялов Е.Л. — https://orcid.org/0000-0002-9412-3874

Локтев В.Б. — https://orcid.org/0000-0002-0229-321X

Кочнева Г.В. — https://orcid.org/0000-0002-2420-0483

Как цитировать:

Ткачева А.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Шевелев О.Б., Разумов И.А., Завьялов Е.Л., Локтев В.Б., Кочнева Г.В. Таргетная терапия глиобластомы человека с использованием онколитического потенциала парвовируса и аттенуированных штаммов вируса осповакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(2):83-91.

Для корреспонденции: Кочнева Галина Вадимовна — д.биол.н., заведующая лабораторией вирусных гепатитов ФБУН Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Рос-
потребнадзора; e-mail: kochneva@vector.nsc.ru, e-mail: g.v.kochneva@yandex.ru