Сахарный диабет (СД) сопровождается ускоренными изменениями сосудов, что делает его ведущей причиной развития сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и смертности. Ключевое звено данных изменений — гипергликемия, инсулинорезистентность, накопление конечных продуктов гликирования (КПГ). Гиперинсулинемия и гипергликемия, как и физиологическое старение, активируют процессы хронического воспаления и окислительного стресса [1]. В стареющем организме, как и в организме пациента с СД, повышается уровень различных маркеров воспаления [С-реактивный белок (СРБ), ИЛ-18, ФНО-α] («инфламмэйджинг» [2]), увеличивается активность перекисного окисления липидов с образованием малонового диальдегида (МДА) и активных форм кислород (АФК). Все это приводит к нарушению синтеза белков, апоптозу клеток и развитию дегенеративных процессов [3].

Одной из причин разной скорости старения сосудов у пациентов с СД2 является изначально разная «генетическая защищенность» от воздействия внешних факторов. Длина теломер и активность теломеразы могут претендовать на роль генетических маркеров биологического возраста сосудов. Теломеры — это концевые участки линейной молекулы ДНК, постепенно укорачивающиеся при каждом делении клеток. Как только длина теломерной ДНК становится угрожающе низкой, запускается P53/P21 — индуцированное старение клетки при сохранении ее метаболической активности [4]. Имеются данные, что длина теломер в лейкоцитах отражает длину теломер в стволовых клетках и соответствует их длине в эндотелиальных прогениторных клетках, что позволяет рассматривать данный параметр как биомаркер старения сосудов. Получены первые указания на укорочение теломер у лиц с СД2 и нарушенной толерантностью к глюкозе [5]. Укорочение теломер может быть связано с развитием СД2, ССЗ и старением сосудов [6].

Вторым генетическим маркером биологического возраста может быть активность теломеразы. Теломераза — фермент, добавляющий особые повторяющиеся последовательности ДНК к 3’-концу цепи ДНК и включающий в себя теломеразную обратную транскриптазу (TERT) и теломеразную РНК (TERС) [7]. В большинстве соматических клеток активность теломеразы достаточно низка. Хотя теломераза не играет важной роли в гомеостазе длины теломер в пожилом возрасте, предполагается, что этот фермент обладает важными нетеломерными функциями по снижению апоптоза, контролю пролиферации клеток и активности митохондрий в клетках человека [8].

Основными пусковыми механизмами патологических процессов, связанных со старением, на клеточном уровне считаются окислительный стресс и хроническое воспаление, вызывающие нерепликативное укорочение ДНК [9]. Теломеры чувствительны к окислительному повреждению молекулы ДНК [10]. АФК in vitro уменьшают содержание в эндотелиальных клетках ядерного белка hTERT и соответственно активность теломеразы. Теломераза может защищать лейкоциты от окислительного стресса, не влияя на длину теломер [8]. Повышенная воспалительная активность ускоряет укорочение теломер как за счет активации размножения клеток, так и за счет высвобождения АФК [9]. Прогрессирующее укорочение теломер с увеличением продолжительности СД2 может быть связано с хроническим воспалением и окислительным стрессом [5]. Взаимосвязь активности теломеразы и хронического воспаления неоднозначна. Хроническое воспаление на ранней стадии через различные сигнальные пути (с участием NF-κB, протеинкиназы С или Akt-киназы) посредством фосфорилирования или транскрипции hTERT способно активировать теломеразу, что, вероятно, компенсирует ускоренное укорочение теломер [11]. Однако на поздних этапах вялотекущего воспаления активность теломеразы снижается, что приводит к укорочению теломер [12].

Цель исследования — изучить взаимосвязи хронического воспаления и окислительного стресса с биологией теломер у лиц с СД2.

В одномоментное исследование включены пациенты с СД2, прошедшие амбулаторное обследование в ФГБУ ГНИЦПМ в 2012—2013 гг. Основную группу составили пациенты в возрасте от 45 до 75 лет с длительностью заболевания не более 12 мес и содержанием HbА1с от 6,5 до 9,0%. В группу контроля включали лиц без СД2, не имеющих клинических проявлений ССЗ, обратившихся в центр для профилактического консультирования.

Критерии исключения: СД1 и другие специфические типы СД, артериальная гипертония (АГ) 3-й степени (АД >180/100 мм рт.ст.), регулярный прием гипотензивных препаратов, регулярный прием сахароснижающих препаратов, тяжелые диабетические микроангиопатии (препролиферативная и пролиферативная диабетическая ретинопатия, хроническая болезнь почек 3б, 4 и 5 стадии), ССЗ (хроническая сердечная недостаточность II—IV классов (NYHA), клапанные пороки сердца), хроническая печеночная недостаточность, онкологические заболевания, беременность, лактация.

Всеми пациентами было подписано информированное согласие на участие в исследовании. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ «ГНИЦПМ» Минздрава России. Протокол заседания ЛЭК № 8 от 29.11.11.

На этапе скрининга всем пациентам проводилось стандартное клиническое обследование: сбор анамнеза, клинический осмотр, в том числе измерение массы тела и роста с расчетом индекса массы тела (ИМТ), измерение систолического (САД) и диастолического артериального давления (ДАД) на калиброванном приборе с использованием плечевой манжеты (HEM-7200 M3, «Omron Healthcare», Япония). АД измеряли после 10-минутного отдыха на правой руке в положении сидя 3 раза через 2 мин; в анализ включали среднее из трех измерений. Проводили забор крови для лабораторных анализов (клинический и биохимический), регистрацию ЭКГ и пробу с физической нагрузкой [тредмил-тест по протоколу BRUCE (Intertrack, SCHILLER)]. Из 250 пациентов, прошедших скрининг, 189 соответствовали критериям включения. У всех их оценивали состояние углеводного обмена, определяли длину теломер и активность теломеразы, регистрировали выраженность окислительного стресса и хронического воспаления.

Концентрацию глюкозы в плазме определяли глюкозооксидазным методом на анализаторе SAPPHIRE-400 с использованием диагностических наборов DiaSys. Уровень НbА1с регистрировали методом жидкостной хроматографии на анализаторе Sapphire 400 («Niigata Mechatronics», Япония) по стандартной методике производителя.

Измерение относительной длины теломер периферических лимфоцитов проводилось на геномной ДНК [13]. В ходе анализа методом ПЦР в реальном времени оценивали количество ДНК с теломерной последовательностью в геноме. Параллельно проводили ПЦР в реальном времени к однокопийному участку геномной ДНК. Исходили из пропорциональности отношения количеств теломерной и однокопийной матриц длине теломер.

Для определения теломеразной активности использовали методику [14] с некоторыми модификациями. Активность фермента исследовали в выделенной моноцитарной фракции клеток крови (примерно 10 000 клеток на анализ). Клетки моноцитов лизировали буфером с мягким детергентом, отделяя экстракт. С экстрактом проводили теломеразную полимеразную реакцию; полученные продукты амплифицировали с помощью ПЦР в реальном времени. Количество продуктов теломеразной реакции пропорционально активности теломеразы (амплификатор Mastercycler («Eppendorf», Германия).

Для оценки выраженности окислительного стресса исследовали концентрацию МДА методом люминолзависимой хемилюминисценции в цельной крови.

Для оценки выраженности хронического воспаления исследовали концентрацию фибриногена, высокочувствительного С-реактивного белка (СРБ) (иммунотурбодиметрический метод с использованием анализатора SAPPHIRE-400), ИЛ-6 (иммуноферментный метод).

Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской Декларации. Протокол исследования был одобрен Этическими комитетами всех участвующих клинических центров. До включения в исследование у всех участников было получено письменное информированное согласие.

Использовали пакет прикладных статистических программ SAS 9.1 (Statistical Analysis System, «SAS Institute Inc.», США). Все данные вводили в табличный процессор, после чего проводили разведочный анализ на предмет выявления ошибок ввода и пропущенных значений. Для количественных параметров применяли тест асимметрии и эксцесса, который выявил нормальное распределение большинства параметров. Количественные данные представлены в виде средних значений и средних квадратичных отклонений (М±SD). Средние значения клинических параметров сравнивали в двух группах с использованием одномоментного анализа для непрерывных переменных и критерия χ² для категориальных переменных. Для частотных показателей применяли модифицированный t-критерий Стьюдента с учетом arcsin-преобразования Фишера. Для выявления меры линейной связи между параметрами проводили корреляционный анализ (ранговые корреляции Спирмена). Для оценки независимых взаимосвязей между параметрами использовали многомерные регрессионные уравнения и множественный линейный регрессионный анализ. После измерения длины теломер проводили дополнительное деление пациентов на ранги в зависимости от значений параметра. В группу первого ранга вошли пациенты с очень малой длиной теломер: от минимального значения в общей группе до границы первой квартили (т.е. ниже 25% границы распределения). В группу второго ранга вошли пациенты с длиной теломер от медианы распределения до нижних квартилей. В группу третьего ранга вошли пациенты с длиной теломер от медианы распределения до 75% границы распределения. В группу четвертого ранга были отнесены лица с очень большой длиной теломер, составляющей верхнюю квартиль распределения. Нулевая гипотеза отвергалась при р<0,05.

Всего в исследование включены 189 пациентов (64 мужчины и 125 женщин), которых объединяли в две группы: с СД2 (n=50) и без СД (n=139). Длительность СД2 составила 0,9±0,089 года. Средний возраст пациентов группы СД2 составил 58,4±7,9 года, а группы контроля — 57,45±8,14 года (p=0,48). В группе СД2 САД равнялось 131,76±14,7 мм рт.ст., а в группе контроля — 127,78±16,5 мм рт.ст. (p=0,13). Уровень МДА в группе СД2 составил 3,193±0,98 мкмоль/л, в группе контроля — 3,195±0,82 мкмоль/л (р=0,98). Средний уровень ИЛ-6 в группе СД2 равнялся 3,37±1,14 пг/мл, в группе контроля — 5,07±0,87 пг/мл (р=0,27).

В группе диабета доля мужчин была выше, чем в группе здоровых лиц (46% против 29%) (р=0,013). Соотношение мужчины/женщины в группе СД2 составило 46/54% против 29/71% в группе контроля (p=0,013). ИМТ пациентов группы СД2 был значимо выше, чем у здоровых лиц: 30,28±5,42 против 27,68±4,60 кг/м² (р=0,002). ДАД в группе СД2 составляло 83,02±11,3 мм рт.ст. против 78,6±9,3 мм рт. ст, в группе контроля (p=0,015). У пациентов с СД2 длина лимфоцитарных теломер оказалась существенно короче (р=0,031), а активность теломеразы существенно ниже (р=0,039), чем у здоровых лиц. В группе СД2 уровень глюкозы плазмы натощак (ГПН) и НbА1с был значимо выше, чем в группе контроля (р<0,001). У пациентов с СД2 значимо выше оказалась и активность маркеров хронического воспаления: СРБ — 6,34±1,06 против 3,82±0,41мг/л (р=0,031), наличие повышенного фибриногена — 0,30±0,04 против 0,11±0,03 (р=0,004). Основные характеристики пациентов представлены в табл. 1.

Медиана относительной длины теломер составила 9,75. Все пациенты со значением длины теломер ниже этого показателя были отнесены к группе «коротких» теломер, а те, у которых этот показатель превышал данное значение — к группе «длинных» теломер.

Уровень СРБ у пациентов с СД2 и «короткими» теломерами был значимо повышен (р=0,02). Не выявлено значимой разницы в уровнях МДА, фибриногена и ИЛ-6 между двумя группами (р=0,09). У лиц с СД2 и «короткими» теломерами уровень ГПН был значительно более высоким (р=0,02). Активность теломеразы не различалась между группами; однако у пациентов с СД2 и «короткими» теломерами чаще встречались низкие показатели активности теломеразы (менее общей медианы). В группе здоровых пациентов между лицами с «короткими» и «длинными» теломерами значимых различий по показателям углеводного обмена, выраженности окислительного стресса и хронического воспаления выявлено не было (табл. 2).

У пациентов с СД2 и «короткими» теломерами был значимо выше уровень СРБ и чаще встречался повышенный фибриноген. Различий в уровнях МДА, фибриногена, ИЛ-6 выявлено не было. Активность теломеразы была несколько ниже у пациентов с СД2 и «короткими» теломерами (р=0,063). «Низкие» же показатели активности теломеразы встречалось у пациентов с СД2 и «короткими» теломерами значимо чаще (р=0,049).

У лиц с «длинными» теломерами маркеры хронического воспаления и окислительного стресса, как и активность теломеразы, практически не зависели от наличия СД2 (табл. 3).

Медиана активности теломеразы составила 0.50. Все пациенты с меньшим значением этого показателя были отнесены к группе «низкой» активности теломеразы, а те, у которых активность теломеразы превышала это значение, — к группе «высокой» активности теломеразы. У пациентов с СД2 состояние углеводного обмена, активность маркеров окислительного стресса и хронического воспаления не различались между этими группами, за исключением более коротких теломер в группе с «низкой» активностью теломеразы (р=0,02). В группе контроля также не было выявлено зависимости уровней окислительного стресса, СРБ и ИЛ-6 от активности теломеразы, однако у лиц с «высокой» активностью теломеразы обнаруживались более высокие показатели фибриногена (табл. 4).

У пациентов с СД2 и «низкой» активностью теломеразы был выше уровень СРБ, чаще встречался повышенный фибриноген, короче была длина теломер. Уровень ИЛ-6, МДА и фибриногена в группе «низкой» активности теломеразы не зависели от наличия СД2. В группе «высокой» активности теломеразы лица с СД2+ и СД2– не различались по состоянию окислительного стресса, хронического воспаления и длине теломер (табл. 5).

У пациентов с СД2 найдены ассоциации между относительной длиной теломер и ГПН, СРБ, «низкой» активностью теломеразы, но не выявлено корреляций с возрастом, АД, ИМТ, НbА1с, МДА, фибриногеном и ИЛ-6 (табл. 6).

В группе СД2+ обнаружена положительная корреляция только между активностью теломеразы и очень большой длиной теломер. В группе контроля активность теломеразы оказалась положительно связанной с САД, ДАД, уровнями СРБ и фибриногена (табл. 7).

В дальнейшем был проведен множественный линейный регрессионный анализ, где в качестве зависимой переменной использовалась относительная длина теломер, а в качестве независимых — возраст, ГПН, СРБ, «низкая» активность теломеразы. Выяснилось, что с длиной теломер независимо связаны лишь ГПН и СРБ (табл. 8).

При использовании активности теломеразы в качестве зависимой переменной, а в качестве независимых — возраст, ДАД, ГПН, СРБ, фибриноген, выяснилось, что в группе СД2– независимо связанными с активностью теломеразы оказались лишь ДАД (обратная связь) и фибриноген (прямая связь) (табл. 9). В группе же СД2+ не было выявлено независимой связи изучаемых параметров с активностью теломеразы (табл. 10).

Мы нашли, что у пациентов с СД2 длина теломер в среднем короче, чем у здоровых людей. Это согласуется с результатами других авторов [15]. Однако в исследовании M. Sampson и соавт. [17] не было выявлено связи между укорочением длины лимфоцитарных теломер и показателями углеводного обмена (возможно, по причине малочисленности группы). В нашем исследовании выявлены значимые различия в НbА1с и ГПН у пациентов с СД2 с «длинными» и «короткими» теломерами, а также обнаружена отрицательная связь между длиной теломер и ГПН. Можно утверждать, что у пациентов с СД2 более короткие теломеры ассоциированы с неудовлетворительным контролем диабета, а гипергликемия в свою очередь может оказывать повреждающее действие на показатели репликативного старения.

Мы нашли, что активность теломеразы у пациентов с СД2 ниже, чем у здоровых людей, что согласуется с имеющимся немногочисленным данными [17]. Роль теломеразы в процессе нормального старения неоднозначна и изучена недостаточно. Нами не было выявлено связи активности теломеразы с длиной теломер, что согласуется с мнением о незначительной роли теломеразы в поддержании гомеостаза длины теломер в пожилом возрасте [8].

Повреждающее действие гипергликемии на биологию теломер, в том числе в клетках эндотелия, реализуется через механизм окислительного стресса [16] и хронического воспаления [9]. Однако значимые различия в уровне МДА между группами СД2+ и СД2– отсутствовали (вероятно, в силу небольшой длительности СД и отсутствия выраженной хронической гипергликемии, так как именно длительная гипергликемия связана с развитием выраженного и стойкого окислительного стресса). Возможно, необходимо применение более точных показателей окислительного стресса, таких как мочевая экскреция 8-изо-простагландина F2α. Мы нашли более высокие уровни воспалительных маркеров у пациентов с СД2, чем у лиц контрольной группы. Еще один воспалительный маркер, ИЛ-6, как недавно выяснилось, обладает множественными эффектами, являясь не только цитокином, но и миокином, стимулируя миогенез и благотворно влияя на энергетический метаболизм [18]. Возможно, поэтому уровень ИЛ-6 в контроле оказался несколько более высоким, что, однако, требует дальнейшего изучения.

Хроническое воспаление приводит к преждевременному старению клеток, укорочению теломер посредством активации размножения лимфоцитарных клеток и активации высвобождения АФК, вызывающих окислительное повреждение концевой части ДНК [10]. В 2012 г. было показано, что прогрессирующее укорочение теломер с увеличением продолжительности СД2 может быть связано с параллельно увеличивающимся окислительным стрессом и хроническим воспалением [5]. Наши результаты согласуются с данными ранее проведенных исследований. Мы обнаружили более высокие уровни СРБ и несколько повышенные уровни МДА у пациентов с СД2 и короткими теломерами, чем у пациентов с длинными теломерами. Имела место отрицательная связь между длиной лимфоцитарных теломер и классическим маркером хронического воспаления — СРБ, что указывает на участие хронического воспаления в укорочении теломер у пациентов с СД2. В группе контроля связь между СРБ и длиной теломер отсутствовала, что согласуется с результатами других исследований [19]. Отсутствие связи между ИЛ-6, фибриногеном и длиной теломер в обеих группах можно объяснить малой изменчивостью этих показателей. К тому же, опираясь только на уровень циркулирующих цитокинов, можно недооценить степень местного воспаление в тканях.

Данные литературы [12] о связи хронического воспаления с активностью теломеразы противоречивы. Длительное хроническое воспаление приводит к истощению теломеразы, что мы и наблюдали у пациентов с СД2. При менее выраженном и менее длительном хроническом воспалении, как это имеет место при метаболическом синдроме или умеренном атеросклерозе, напротив, наблюдается увеличение активности теломеразы [20], что, вероятно, носит компенсаторный характер, замедляя уменьшение длины теломер в активно делящихся клетках под влиянием воспалительных цитокинов. Действительно, в группе контроля нами была обнаружена положительная связь между активностью теломеразы и маркерами хронического воспаления.

Важно подчеркнуть, что, согласно нашим данным, уровень окислительного стресса, хронического воспаления и активность теломеразы у пациентов с СД2 и «длинными» теломерами значимо не отличались от соответствующих показателей у здоровых лиц. Можно предположить, что при небольшой длительности СД2 генетически обусловленная большая длина теломер защищает пациентов от повреждающего действия окислительного стресса и хронического воспаления, обеспечивая более качественное и быстрое восстановление поврежденных тканей, в том числе сосудов. Напротив, у пациентов с СД2 и «короткими» теломерами, даже при небольшой длительности заболевания, выраженность хронического воспаления и степень снижения активности теломеразы были более значительными. Следует иметь в виду, что пациенты группы СД2 и контроля были сравнимы по возрасту.

Накапливается все больше доказательств, что укорочение теломер является ключевым компонентом уменьшения резервов стволовых клеток и ассоциированной с возрастом дегенерации тканей. Связь СД2 с процессами клеточного старения и выраженностью хронического воспаления и окислительного стресса может объяснять более высокую частоту развития ССЗ при этом заболевании. Дальнейшие исследования позволят сформировать с учетом длины теломер среди пациентов с СД2 группу лиц, нуждающихся в более агрессивном контроле углеводного обмена, что обеспечит более персонализированный подход к лечению заболевания.

1. У пациентов с СД2 длина теломер в среднем короче, а активность теломеразы ниже, чем у здоровых людей. Не выявлено значения активности теломеразы в изменении длины теломер.

2. Уровень МДА у пациентов с СД2 и здоровых лиц практически одинаковы. Хроническое воспаление более выражено у пациентов с СД2, чем у здоровых лиц аналогичного возраста. Хроническое воспаление играет ведущую роль в укорочении теломер и повышении активности теломеразы.

3. У пациентов с СД2 и «длинными» теломерами выраженность окислительного стресса и хронического воспаления не отличаются от соответствующих показателей у здоровых лиц

4. У пациентов с СД2 «короткие» теломеры ассоциированы с неудовлетворительным контролем диабета и более выраженным хроническим воспалением.

5. «Длинные» теломеры защищают пациентов с СД от повреждающего действия окислительного стресса и хронического воспаления.

Конфликт интересов отсутствует.

Исследование было проведено в рамках Государственного задания «Изучение молекулярных механизмов атерогенеза в целях разработки методов ранней диагностики доклинического атеросклероза как основного патофизиологического механизма развития сердечно-сосудистых заболеваний и их осложнений».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Е.Н. Дудинская, О.Н. Ткачева, И.Д. Стражеско, Е.В. Акашева.

Сбор и обработка материала — Н.В. Браилова, Е.В. Плохова, В.С. Пыхтина.

Статистическая обработка данных — В.А. Выгодин.

Написание текста — Н.В. Браилова.

Редактирование — Е.Н. Дудинская, О.Н. Ткачева, М.В. Шестакова, С.А. Бойцов.

Благодарности

Коллектив авторов благодарит А.С. Кругликову, И.Н. Озерову, Н.В. Гомыранову (ФГБУ «Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины» МЗ РФ) и Д.А. Скворцова (Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского ГБОУ ВПО МГУ им. М.В. Ломоносова) за помощь в проведении исследования.