Введение

Эндометриоз — это гинекологическое заболевание, характеризующееся наличием вне полости матки ткани, морфологически и функционально схожей с эндометрием, а также хроническим и рецидивирующим течением. По данным литературы, эндометриоз поражает около 10% женщин репродуктивного возраста [1—3]. Наиболее частой клинической картиной является тазовая боль, вместе с тем в ряде случаев у пациенток отсутствует прямая корреляция между выраженностью боли и тяжестью эндометриоза [4]. Эндометриоз может приводить к нарушению анатомо-топографических взаимоотношений в малом тазу, перистальтики маточных труб, снижению качества гамет и репродуктивной функции, акушерским осложнениям и является одной из причин бесплодия. Согласно современным данным, около 50% женщин с бесплодием болеют эндометриозом [5—8].

В ходе гистологического исследования очагов эндометриоза выявлено, что их основополагающим компонентом является фиброзно-мышечная ткань, тогда как подобные эндометрию элементы представлены лишь редкими пальцевидными отростками, состоящими из железистого и стромального компонентов [9, 10]. Чрезвычайно важной гистологической особенностью эндометриоза является наличие плотной соединительной ткани в очагах поражения [11, 12], что особенно характерно для глубокой инфильтративной формы заболевания и эндометриоидных кист яичников [13].

Циклические изменения в очагах эндометриоза вызывают воспаление, окислительный стресс и высвобождение активных форм кислорода и железа [14, 15], которые провоцируют (эпи)генетические повреждения ДНК и возникновение соматических мутаций, способствуют эпителиально-мезенхимальному переходу и трансдифференцировке фибробластов в миофибробласты через индукцию трансформирующего фактора роста TGF-β/Smad сигнального пути. Это приводит к выработке гладкомышечного актина α (α-SMA) и коллагена, повышению сократительной способности клеток, что ведет к усилению гладкомышечной метаплазии и фиброзу [16]. Повышение уровня активных форм кислорода может приводить к увеличению повреждений ДНК, вызывать остановку клеточного цикла и нарушение репликации ДНК [17].

Формирование фиброзной ткани характеризуется избыточным накоплением компонентов внеклеточного матрикса внутри и вокруг воспаленной или поврежденной ткани. Биологический процесс фиброза требует участия активированных тромбоцитов, макрофагов и миофибробластов, которые, в свою очередь, способствуют повышению уровня TGF-β1 и отложению коллагена [18].

Трансформирующий фактор роста β (TGF-β) — это цитокин, существующий в трех изоформах: TGF-β1, TGF-β2 и TGF-β3. TGF-β играет важную роль в нормальном функционировании эндометрия, регулируя менструальный цикл и процесс децидуализации [19]. Обнаружено, что уровень TGF-β1 в перитонеальной жидкости у женщин с перитонеальным эндометриозом значительно повышен по сравнению с женщинами без этого заболевания [20].

Повышенная экспрессия TGF-β1 также наблюдается при таких процессах, как эпителиально-мезенхимальный переход, экспрессия матриксных металлопротеиназ, активация путей SMAD2/3, ангиогенез, подавление иммунной системы и предотвращение апоптоза. Ряд исследований также показал, что TGF-β1 снижает активность естественных киллеров (NK-клеток), регулирует дифференцировку Т-регуляторных клеток (Treg) и продукцию цитокинов, таких как IL-17 и IL-21, и это свидетельствует, что дисрегуляция указанных биологических процессов, вероятно, вовлечена в патогенез формирования эндометриоидных очагов [21—25].

TGF-β1 является основным профибротическим цитокином, индуцирующим пролиферацию, миграцию и продукцию матрикса фибробластами и миофибробластами, что играет ключевую роль в образовании спаек [26]. Миофибробласты, в свою очередь, представляют собой сократительные немышечные клетки, которые активируются в ответ на травму с целью восстановления поврежденного внеклеточного матрикса. Эти клетки могут дифференцироваться из различных клеточных линий, включая резидентные фибробласты, находящиеся в тканях. Маркер активации миофибробластов — α-SMA. При активации миофибробласты проявляют повышенную пролиферацию, миграционную способность, продукцию цитокинов и интерстициального матрикса, что приводит к нарушению функции интактных остаточных тканей и изменению биохимического и биофизического микроокружения и в результате к развитию фиброза. TGF-β1 способен индуцировать неоэкспрессию α-SMA фибробластами in vivo и in vitro, превращая их в миофибробласты [27].

S. Mechsner и соавт. также изучали образцы перитонеального эндометриоза. В этом исследовании в очагах перитонеального эндометриоза и эндометриоидных кистах яичников в 76% случаев (120 образцов) обнаружена экспрессия α-SMA [28], тогда как в проведенном M.L. Barcena de Arellano и соавт. исследовании очагов перитонеального эндометриоза экспрессия α-SMA подтверждена во всех 60 образцах [29].

Q. Zhang и соавт. показали, что активированные тромбоциты способствуют трансформации фибробластов в миофибробласты при эндометриозе посредством высвобождения TGF-β1 и активации TGF-β/Smad сигнального пути, тем самым вызывая фибробласт-миофибробластный переход, который приводит к увеличению сократимости клеток, выработке коллагена, экспрессии α-SMA и в итоге к фиброзу. Интересно, что блокада TGF-β сигнального пути обращает эти процессы вспять [30].

Недавние исследования показали, что в результате миофибробластной дифференцировки происходит накопление гиалуроновой кислоты (ГК) в перицеллюлярном матриксе, окружающем дифференцированные клетки, которое способствует TGF-β1-опосредованному переходу фибробластов в миофибробласты [31]. При этом ингибирование синтеза ГК в кожных фибробластах приводило к отмене TGF-β1-опосредованной миофибробластной фенотипической конверсии, демонстрируя ключевую роль ГК в фибробласт-миофибробластном переходе. Позднее показано, что для TGF-β1 миофибробластной трансформации необходима совместная колокализация на липидных рафтах рецептора для ГК, CD44 и рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), который, как известно, усиливает экспрессию TGF-β1 [32].

Согласно экспериментальным данным и метаанализу, выполненному Л.В. Адамян и соавт. [33, 34], ГК представляет собой гликозаминогликан соединительной ткани, синтезируемый ферментами HA-synthase (HAS1, HAS2 и HAS3). В неизмененных тканях ГК играет роль в поддержании стабильности внеклеточного матрикса и гидратации тканей. Однако повышенная экспрессия низкомолекулярной ГК и ее рецептора клеточной поверхности (CD44) обнаружена при многочисленных фиброзных состояниях, связанных с дисфункцией органов [35].

ГК существует в различных молекулярных формах, которые играют разные роли в организме. Высокомолекулярная ГК (более 100 000 Да) участвует в поддержании гомеостаза тканей и блокирует воспалительные процессы, предотвращая рекрутирование моноцитов и нейтрофилов, подавляя экспрессию провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α, и поддерживая структурную целостность тканей, заполняя собой межклеточные пространства. В хрящах и стекловидном теле глаза ГК действует как антиангиогенный фактор, препятствуя образованию новых кровеносных сосудов [36].

Напротив, низкомолекулярная ГК (менее 100 000 Да) образуется в условиях воспаления из высокомолекулярной формы под действием гиалуронидаз. Она участвует в процессах заживления тканей и может усиливать воспаление и фиброз, связываясь с рецепторами, такими как CD44 и TLR4, что активирует миофибробласты и стимулирует синтез внеклеточного матрикса. Особенно опасна форма ГК, цепи которой состоят из шести и более мономеров, так как она вызывает воспалительные реакции и может способствовать патологическим изменениям тканей, включая фиброз [37].

ГК, характеризующаяся цепями длиной менее шести мономеров, в отличие от низкомолекулярной ГК, которая может активировать воспалительные процессы, не взаимодействует с рецепторами CD44 и не активирует воспалительные сигнальные пути. Более того, она способна блокировать рецепторы TLR2 и TLR4, что предотвращает воспаление и фиброз [36]. Таким образом, различие между высокомолекулярной и низкомолекулярной ГК заключается не только в молекулярной массе, но и в функциональных особенностях: первая выполняет защитные и структурные функции, тогда как вторая может способствовать воспалению и тканевому ремоделированию.

В исследовании 2019 г. показано, что плазменные биомаркеры — высокоподвижные белки группы B1 (HMGB1), остеопонтин (OPN) и ГК эффективны для диагностики эндометриоза. Авторы использовали мышиную модель эндометриоза и изучили влияние этих маркеров на прогрессирование заболевания, уделяя особое внимание развитию фиброза, который является конечным результатом формирования поражений [38]. ГК важна для связывания эпителиальных и стромальных клеток эндометрия с мезотелием, что играет роль в раннем развитии эндометриоза [39]. Более того, содержание некоторых сплайс-вариантов CD44, основного рецептора ГК, повышено у женщин с эндометриозом [40], а нокаут CD44 приводит к снижению прогрессирования эндометриоза у мышей [41]. Таким образом, ингибирование системы CD44 и ГК может замедлить формирование эндометриоидных очагов [42], что может быть потенциальным механизмом для таргетной и негормональной терапии эндометриоза.

Клеточные линии, полученные из нормальных и патологических тканей, играют важную роль в биомедицинских исследованиях благодаря своей способности воспроизводить клеточные процессы in vitro. Использование культур клеток в качестве биологических моделей делает возможным установление характера биологической активности изучаемых соединений непосредственно на клеточном уровне. Эти модели предоставляют исследователям возможность изучать механизмы заболеваний, тестировать новые терапевтические подходы и оценивать эффективность лекарств, что имеет большое значение для дальнейшего применения в практической деятельности [43].

Одним из преимуществ исследований на клеточных линиях является сокращение сроков доклинических испытаний новых препаратов, что, с одной стороны, избавляет от страданий большое количество животных (этический фактор), а также позволяет оценить повреждающее действие лекарственных веществ и делает их незаменимыми инструментами в биомедицинских исследованиях [44].

С другой стороны, испытания на культурах клеток и их результаты далеко не всегда показывают реальное воздействие исследуемого вещества на живой организм в силу пренебрежения процессами метаболизма и окисления в мышцах, протекающими в ходе жизнедеятельности. Таким образом, культуры клеток как модельные тест-системы могут быть использованы для решения самых разнообразных исследовательских задач в области изучения влияния ряда представляющих практический интерес потенциальных или уже используемых лекарственных препаратов. Доклиническая апробация как на клеточной линии, так и на животных моделях очень важна для исследования новых фармакологических веществ, а в сочетании они дополняют друг друга.

Цель исследования — определить эффективность бовгиалуронидазы азоксимер в качестве средства для профилактики и лечения эндометриоз-ассоциированного спаечного процесса в эксперименте на клеточной культуре NIH/3T3 фибробластов путем оценки фенотипа клеток, полученных после одновременной инкубации клеточной линии фибробластов с TGF-β1 и бовгиалуронидазой азоксимер в течение 24 ч (профилактика), а также оценки влияния препарата на активацию уже дифференцированных миофибробластов (лечение).

Материал и методы

Данное экспериментальное исследование на клеточной культуре NIH/3T3-фибробластов (in vitro) проводилось в лаборатории Научно-исследовательского института канцерогенеза ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Для экспериментального моделирования эндометриоза использована клеточная культура Murine NIH/3T3 cells (American Type Culture Collection, AddexBio, Manassas, VA).

Показано, что клеточные линии фибробластов при инкубации с TGF-β1 в течение 72 ч подвергаются дифференцировке в миофибробласты (начинают экспрессировать виментин, α-SMA, коллаген I типа, фибронектин и т.д.) [45]. В частности, на линии человеческих фибробластов легких показано, что TGF-β1-зависимый фибробласт-миофибробластный переход связан с эндогенной ГК. Ингибирование синтеза ГК с использованием 4-Methylumbelliferone приводило к снижению их дифференцировки в миофибробласты [46].

В качестве основного вмешательства использована бовгиалуронидаза азоксимер (ЛГ) — ферментный препарат, представляющий собой модифицированную форму гиалуронидазы, азоксимер — биополимер, который улучшает фармакологические свойства гиалуронидазы, увеличивая ее стабильность и продолжительность действия в организме. В качестве препарата сравнения (положительный контроль) использован 4-Methylumbelliferone (4-MU) или 7-hydroxyl4methylcoumarin — ингибитор синтеза ГК и ее рецептора CD44 in vitro и in vivo [45, 47].

Результаты

Результаты эксперимента №1 (создание модели эндометриоза) и эксперимента №2 (профилактика эндометриоза)

Бовгиалуронидаза азоксимер снижает TGF-β1-индуцированную экспрессию коллагена I типа в NIH/3T3- фибробластах in vitro. Стимуляция мышиной клеточной линии фибробластов NIH/3T3 in vitro с TGF-β1 в концентрации 5 нг/мл в течение 24 ч приводила к их дифференцировке в сторону миофибробластов, которая сопровождалась статистически значимой повышенной экспрессией α-SMA, фактора роста соединительной ткани (CCN2) и коллагена I типа. Добавление к NIH/3T3-фибробластам ингибитора синтеза ГК 4-MU в концентрации 1 mM показало значимое снижение TGF-β1-индуцированной экспрессии α-SMA и коллагена I типа, что подтверждается раннее опубликованными работами. Добавление бовгиалуронидазы азоксимер к NIH/3T3-фибробластам не приводило к изменению TGF-β1-индуцированной экспрессии α-SMA и CCN2, однако вызывало дозозависимое снижение экспрессии коллагена I типа, являющегося одним из основных важных фиброзных маркеров (рис. 1 на цв. вклейке).

Рис. 1. TGF-β1 индуцирует дифференцировку NIH/3T3-фибробластов in vitro. Бовгиалуронидаза азоксимер снижает экспрессию фиброзного маркера коллагена I типа in vitro.

NIH/3T3 фибробласты стимулировали с TGF-β1 (5нг/мл) в присутствии бовгиалуронидазы азоксимер (ЛГ, 3U/мл или 30U/мл) или 4-MU (1mM) в течение 24 ч с последующим проведением ПЦР-РВ на QuantStudioTM 5 Real-Time PCR System для измерения экспрессии генов. Относительная экспрессия гена рассчитывалась по формуле 2–(Ct интересующего гена – Ct гена домашнего хозяйства), где Ct — пороговый цикл. * — p<0,05, ** — p<0,01; тест множественных сравнений Даннетта; # — p<0,05; t-тест Стьюдента. Данные представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней М±SEM.

а — TGF-β1 повышает экспрессию a-SMA. Добавление ЛГ вместе с TGF-β1 не влияет на TGF-β1-индуцированную экспрессию a-SMA, добавление 4-MU снижает TGF-β1-индуцированную экспрессию a-SMA; б — TGF-β1 повышает экспрессию CCN2. Добавление ЛГ или 4-MU вместе с TGF-β1 не влияет на TGF-β1-индуцированную экспрессию CCN2; в — TGF-β1 повышает экспрессию коллагена I типа. Добавление ЛГ или 4-MU вместе с TGF-β1 снижает TGF-β1-индуцированную экспрессию коллагена I типа.

Бовгиалуронидаза азоксимер подавляет TGF-β1-опосредованное усиление метаболической активности NIH/3T3 фибробластов in vitro. TGF-β1 индуцировал значимое увеличение метаболической активности NIH/3T3 фибробластов, которая прямо коррелирует с уровнем пролиферативной активности, при этом добавление к клеткам ЛГ в дозе 3 U/мл вызывало значимое снижение метаболической активности клеток, индуцированной TGF-β1. ЛГ в дозе 30 U/мл показала более выраженный эффект на уровень метаболической активности, сопоставимый с клетками в нестимулированном контроле (рис. 2 на цв. вклейке).

Рис. 2. Бовгиалуронидаза азоксимер приводит к снижению TGF-β1-опосредованной метаболической активности NIH/3T3-фибробластов in vitro.

NIH/3T3 фибробласты стимулировали с TGF-β1 (5 нг/мл) в присутствии бовгиалуронидаза азоксимер (3 U/мл или 30 U/мл) в течение 48 ч с последующим проведением теста на метаболическую активность и измерением поглощения супернатанта на планшетном ридере Multiskan Go при длине волны 570 нм. Данные представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней М±SEM. ** — p<0,01, ****— p<0,0001; тест множественных сравнений Даннетта (Dunnett’s multiple comparison test).

Бовгиалуронидаза азоксимер замедляет TGF-β1-индуцированную миграцию NIH/3T3 фибробластов in vitro. Для оценки миграционной способности NIH/3T3 фибробласты посажены в 6-луночную плашку в среде, содержащей 2,5% сыворотки, и с помощью наконечника объемом 200 мкл в серединке каждой лунки создана «рана». Изображения заживления «раны» получены в точках 0 и 24 ч. Полученные данные показали, что TGF-β1 усиливал скорость миграции клеток в «рану» по сравнению с нестимулированным контролем, тогда как ЛГ дозозависимо замедляла TGF-β1-опосредованную миграцию клеток в «рану» (рис. 3 на цв. вклейке).

Рис. 3. Бовгиалуронидаза азоксимер снижает TGF-β1-опосредованную миграцию NIH/3T3-фибробластов в «рану» in vitro.

NIH/3T3 фибробласты стимулировали с TGF-β1 (5 нг/мл) в присутствии бовгиалуронидаза азоксимер (3 U/мл или 30 U/мл) в среде, содержащей 2,5% сыворотки (FBS). Наконечник объемом 200 мкл использован для создания «раны». Изображение создания «раны» — точка 0 ч. Изображения заживления «раны» получены спустя 24 ч. а — зарастание раны нестимулированными фибробластами; б — зарастание раны фибробластами с добавлением TGF-β1; в — зарастание раны фибробластами с добавлением TGF-β1 и ЛГ в концентрации 3 U/ml; г — зарастание раны фибробластами с добавлением TGF-β1 и ЛГ в концентрации 30 U/ml. ЛГ — бовгиалуронидаза азоксимер.

Поскольку в среде с 2,5% содержанием сыворотки в нестимулированном контроле мы наблюдали значительное количество мигрировавших клеток, а нам хотелось увидеть миграцию отдельных клеток, мы решили снизить содержание сыворотки в среде до 0,1% и повторить эксперимент. Снижение концентрации сыворотки позволило нам снизить миграцию клеток в «ране» в нестимулированном контроле, при этом TGF-β1, как и в прошлом эксперименте, усиливал миграцию. ЛГ в дозе 30 U/мл значительно ингибировала TGF-β1-опосредованную миграцию. Более того, уровень миграции в нестимулированном контроле был выше, чем при добавлении ЛГ в дозе 30 U/мл (рис. 4 на цв. вклейке).

Таким образом, бовгиалуронидаза азоксимер статистически значимо подавляет профибротическую активацию клеток под действием TGF-β1 — снижает экспрессию коллагена I типа, метаболическую активность и миграционную способность.

Рис. 4. Бовгиалуронидаза азоксимер снижает TGF-β1-опосредованную миграцию NIH/3T3-фибробластов в «рану» in vitro.

NIH/3T3 фибробласты стимулировали с TGF-β1 (5 нг/мл) в присутствии бовгиалуронидаза азоксимер (3 U/мл или 30 U/мл) в среде, содержащей 0,1% сыворотки (FBS). Наконечник объемом 200 мкл использован для создания «раны». Изображение создания «раны» — точка 0 ч. Изображения заживления «раны» получены спустя 24 ч. а — зарастание раны нестимулированными фибробластами; б — зарастание раны фибробластами с добавлением TGF-β1; в — зарастание раны фибробластами с добавлением TGF-β1 и ЛГ в концентрации 3 U/ml; г — зарастание раны фибробластами с добавлением TGF-β1 и ЛГ в концентрации 30 U/ml. ЛГ — бовгиалуронидаза азоксимер.

Результаты эксперимента №3 (лечение эндометриоза)

Бовгиалуронидаза азоксимер снижает TGF-β1-индуцированную экспрессию коллагена I типа в дифференцированных миофибробластах in vitro. Для оценки эффекта ЛГ в эксперименте «лечение эндометриоза» фибробласты мышиной клеточной линии NIH/3T3 сначала были дифференцированы в миофибробласты in vitro в присутствии TGF-β1 в концентрации 5 нг/мл в течение 24 ч (данное время является достаточным для их успешной дифференцировки и показано нами в предыдущем эксперименте №1 «создание модели эндометриоза») с последующей 48-часовой стимуляцией с ЛГ или 4-MU.

Стимуляция фибробластов in vitro с TGF-β1 приводила к их дифференцировке в сторону миофибробластов, которая сопровождалась статистически значимой повышенной экспрессией α-SMA, CCN2 и коллагена I типа. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (ПЦР-РВ) показал, что добавление к миофибробластам 4-MU, ингибитора синтеза ГК, в концентрации 0,5 mM не влияло на TGF-β1-индуцированную экспрессию α-SMA, однако приводило к незначительному снижению экспрессии коллагена I типа. ЛГ в концентрации 3 U/ml вызывала незначительное снижение экспрессии α-SMA и статистически значимое снижение экспрессии коллагена I типа, являющегося одним из основных маркеров фиброза (рис. 5 на цв. вклейке). Снижение экспрессии данного маркера в ответ на стимуляцию ЛГ мы наблюдали ранее в эксперименте №2 «профилактика эндометриоза».

Рис. 5. TGF-β1 индуцирует дифференцировку NIH/3T3-фибробластов в миофибробласты in vitro. Бовгиалуронидаза азоксимер снижает экспрессию фиброзного маркера коллагена I типа в дифференцированных миофибробластах in vitro.

NIH/3T3 фибробласты стимулировали с TGF-β1 (5 нг/мл) в течение 24 ч для их дифференцировки в миофибробласты с последующим добавлением к дифференцированным клеткам бовгиалуронидазы азоксимер (3 U/мл) или 4-MU (0,5 mM) на 48 ч. Замена TGF-β1 и препаратов проводилась каждые 24 ч. В полученных образцах измерена экспрессия генов методом ПЦР-РВ на QuantStudioTM 5 Real-Time PCR System. Относительная экспрессия гена рассчитана по формуле: 2–(Ct интересующего гена – Ct гена домашнего хозяйства), где Ct — пороговый цикл. * — p<0,05, ** — p<0,01; тест множественных сравнений Даннетта; # — p<0,05; t-тест Стьюдента. Данные представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней М±SEM. а — добавление ЛГ к дифференцированным миофибробластам показывает тренд на снижение экспрессии α-SMA, добавление 4-MU не влияет на экспрессию α-SMA; б — добавление ЛГ к дифференцированным миофибробластам не влияет на экспрессию CCN2, 4-MU усиливает экспрессию CCN2; в — добавление ЛГ к дифференцированным миофибробластам снижает экспрессию коллагена I типа, добавление 4-MU показывает тенденцию к снижению экспрессии коллагена I типа. ЛГ — бовгиалуронидаза азоксимер.

Бовгиалуронидаза азоксимер снижает TGF-β1-индуцированную экспрессию маркеров фиброза в дифференцированных миофибробластах in vitro. Метод ПЦР-РВ показал, что стимуляция фибробластов in vitro с TGF-β1 приводила к статистически значимому повышению экспрессии CD44, рецептора ГК, и TGF-β1. ЛГ в концентрации 3 U/ml показала выраженный тренд в снижении экспрессии CD44, при этом она значимо снижала TGF-β1-индуцированную экспрессию TGF-β1 и CCL5. Добавленный к дифференцированным миофибробластам 4-MU, ингибитор синтеза ГК, в концентрации 0,5 mM показал более выраженный тренд в снижении экспрессии CD44 и также значимо снижал экспрессию TGF-β1 и CCL5 (рис. 6 на цв. вклейке).

Рис. 6. TGF-β1 индуцирует экспрессию профиброзных маркеров in vitro. Бовгиалуронидаза азоксимер снижает экспрессию TGF-β1 и CCL5 в дифференцированных миофибробластах in vitro.

NIH/3T3 фибробласты стимулировали с TGF-β1 (5 нг/мл) в течение 24 ч для их дифференцировки в миофибробласты с последующим добавлением к дифференцированным клеткам ЛГ (3 U/мл) или 4-MU (0,5 mM) на 48 ч. Замену TGF-β1 и препаратов проводили каждые 24 ч. В полученных образцах измерена экспрессия генов методом ПЦР-РВ на QuantStudioTM 5 Real-Time PCR System. Относительная экспрессия гена рассчитана по формуле 2–(Ct интересующего гена –– Ct гена домашнего хозяйства), где Ct — пороговый цикл. * — p<0,05, ** — p<0,01, *** — p<0,001, тест множественных сравнений Даннетта; # — p<0,05. Данные представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней М±SEM. а — добавление ЛГ или 4-MU к дифференцированным миофибробластам показывает тренд на снижение экспрессии CD44; б — добавление ЛГ или 4-MU к дифференцированным миофибробластам снижает экспрессию TGF-β1; в — добавление ЛГ или 4-MU к дифференцированным миофибробластам снижает экспрессию CCL5. ЛГ — бовгиалуронидаза азоксимер.

Бовгиалуронидаза азоксимер подавляет TGF-β1-опосредованное усиление метаболической активности мифибробластов in vitro.

TGF-β1 индуцировал значимое увеличение метаболической активности мифибробластов, которая прямо коррелирует с уровнем пролиферативной активности, при этом добавление к клеткам ЛГ в дозе 3 U/мл вызывало значимое снижение метаболической активности клеток, индуцированной TGF-β1. ЛГ в дозе 30 U/мл также показала эффект в снижении уровня метаболической активности клеток. 4-MU снижал метаболическую активность миофибробластов до уровня, сопоставимого с уровнем в клетках в нестимулированном контроле (рис. 7 на цв. вклейке).

Рис. 7. Бовгиалуронидаза азоксимер приводит к снижению TGF-β1-опосредованной метаболической активности миофибробластов in vitro.

NIH/3T3 фибробласты стимулировали с TGF-β1 (5 нг/мл) в течение 24 ч для их дифференцировки в миофибробласты с последующим добавлением к дифференцированным клеткам ЛГ (3 U/мл или 30 U/мл) или 4-MU (0,5 mM) на 48 ч. Замену TGF-β1 и препаратов проводили каждые 24 часа. После окончания инкубации проведен тест на метаболическую активность и измерена оптическая плотность супернатанта на планшетном ридере Multiskan Go при длине волны 570 нм. * — p<0,05, ** — p<0,01, тест множественных сравнений Даннетта. Данные представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней М±SEM. ЛГ — бовгиалуронидаза азоксимер.

Бовгиалуронидаза азоксимер замедляет TGF-β1-индуцированную миграцию миофибробластов in vitro. Для оценки миграционной способности миофибробластов, NIH/3T3 фибробласты посажены в 6-луночную плашку в среде, содержащей TGF-β1 в концентрации 5 нг/мл, и инкубированы в течение 24 ч для их дифференцировки в миофибробласты. После окончания инкубации с помощью наконечника объемом 200 мкл в середине каждой лунки создана «рана» и добавлены препараты ЛГ (3 U/мл или 30 U/мл) или 4-MU (0,5 mM) на 48 ч. Изображения заживления «раны» получены в точках 0 и 48 ч. Полученные данные показали, что TGF-β1 усиливал скорость миграции клеток в «рану» по сравнению с нестимулированным контролем. ЛГ в дозе 3 U/мл и 30 U/ml значительно ингибировала TGF-β1-опосредованную миграцию. Препарат положительного контроля 4-MU также показал ослабление миграции миофибробластов в «рану» (рис. 8 на цв. вклейке).

Рис. 8. Бовгиалуронидаза азоксимер снижает TGF-β1-опосредованную миграцию миофибробластов в «рану» in vitro.

NIH/3T3 фибробласты стимулировали с TGF-β1 (5 нг/мл) в среде, содержащей 2,5% сыворотки, в течение 24 ч для их дифференцировки в миофибробласты. После окончания инкубации в дифференцированных клетках создана «рана» с использованием наконечника объемом 200 мкл, произведена замена среды на среду, содержащую 0,1% сыворотки, и добавлены препараты ЛГ (3 U/мл или 30 U/мл) или 4-MU (0,5 mM) на 48 ч. Замену TGF-β1 и препаратов проводили каждые 24 ч. Изображение создания «раны» — точка 0 часов. Изображения заживления «раны» получены спустя 48 ч. а — зарастание раны миофибробластами без добавления TGF-β1; б — зарастание раны миофибробластами с добавлением TGF-β1; в — зарастание раны миофибробластами с добавлением TGF-β1 и ЛГ в концентрации 3 U/ml; г — зарастание раны миофибробластами с добавлением TGF-β1 и 4-MU в концентрации 0,5 мМ.

Таким образом, ЛГ значимо подавляет профибротическую активацию дифференцированных под действием TGF-β1 миофибробластов: снижает экспрессию коллагена I типа, TGF-β1 и CCL2, метаболическую активность и миграционную способность, в то же время незначимо снижает экспрессию генов a-SMA и CD44, что указывает на потенциальное влияние препарата на процесс дифференцировки фибробластов в миофибробласты.

Обсуждение

Опираясь на перечисленные выше собственные данные и данные современной литературы, можно сделать вывод, что спаечный процесс играет чрезвычайно важную роль в прогрессировании эндометриоз-ассоциированного спаечного процесса.

Фиброз, в частности фибробласт-миофибробластный переход, является ключевым моментом в комплексном лечении эндометриоз-ассоциированного спаечного процесса. Частота рецидивирования и хронизация процесса эндометриоза свидетельствуют о необходимости продолжения поиска более эффективных методов лечения, в том числе обеспечивающих благоприятные условия для правильной репаративной регенерации тканей и профилактики спайкообразования и фиброза [48].

Поскольку присутствие миофибробластов и наличие фиброза неотъемлемо для всех форм заболевания (более выраженное при инфильтративных формах), целесообразно воспроизводить данный патологический процесс на животных моделях эндометриоза. В настоящее время модели на мышах, хомяках и крысах создаются путем внутрибрюшинной или подкожной трансплантации аутологичной ткани эндометрия от тех же или сингенных доноров или от человека. Эндометриоз, как правило, экспериментально моделируется хирургическим путем, что также проведено Л.В. Адамян и соавт. в 2003 г. [49—51]. На этих моделях протестировано большое количество соединений с различной функциональной активностью, и многие из них продемонстрировали различную степень ингибирования роста эктопических очагов на крысиной модели. Однако их клиническое апробирование ограниченно из-за несоответствия имеющихся на данный момент моделей на животных реальной природе эндометриоза. Именно поэтому характеристика заболевания на экспериментальной модели также должна включать оценку наличия фиброза [52—55].

Перечисленные ограничения животных моделей акцентируют особое внимание на создании экспериментальных условий, наиболее соответствующих по морфологической структуре очагу заболевания, что является обоснованием применения клеточной линии in vitro для оценки эффективности бовгиалуронидазы азоксимер в профилактике и лечении эндометриоза и эндометриоз-ассоциированного спаечного процесса. При этом, моделируя микросреду для изучения клеточных и молекулярных механизмов заболевания, таких как воспаление, фиброз и эпителиально-мезенхимальный и фибробласт-миофибробластный переход, можно достичь оптимальных условий для проведения эксперимента. Эти экспериментальные модели позволяют исследователям управлять отдельными параметрами, что способствует глубокому пониманию механизмов заболевания, и могут быть использованы в медицине для лечения и оценки результатов [56]. Так, доклинические модели, как in vitro, так и in vivo, играют фундаментальную роль в трансляции научных открытий в клиническую практику, включая разработку лекарственных препаратов, изучение механизмов заболеваний и внедрение персонализированных подходов в медицину. Клеточные линии позволяют ученым воспроизводить различные заболевания на молекулярно-биологическом уровне. Мы рассмотрели данные литературы о применении клеточных линий в моделях различных заболеваний (в онкологии, неврологии, эндокринологии, кардиологии, нефрологии, пульмонологии и гепатологии).

В онкологии модели in vitro, такие как 3D-культуры клеток и органоидов, являются ключевыми для тестирования персонализированных терапевтических подходов, в то время как модели in vivo, например ксенотрансплантаты опухолей на мышах, способствуют разработке иммунотерапии и таргетных препаратов, включая моноклональные антитела [57]. В исследовании нейродегенеративных заболеваний использование моделей in vitro на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) позволяет проводить скрининг потенциальных лекарств, тогда как модели in vivo позволяют оценивать их эффективность [58]. Исследования в области сахарного диабета с использованием моделей in vitro островковых клеток поджелудочной железы способствуют разработке новых инсулиновых формул и лечения, направленного на сохранение бета-клеток, а модели in vivo диабета, например на мышах, необходимы для тестирования аналогов инсулина и препаратов, снижающих уровень глюкозы [59]. В кардиологии модели in vitro кардиомиоцитов используются для изучения воздействия лекарств на сердечную мышцу, тогда как модели in vivo способствовали созданию инновационных методов лечения сердечной недостаточности, атеросклероза и инфаркта миокарда, включая ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), бета-блокаторы и ингибиторы пропротеиновой конвертазы субтилизин-кексинового 9-го типа (PCSK9) [60]. Для хронической болезни почек (ХБП) культуры почечных клеток in vitro позволяют исследовать токсичность лекарств и механизмы почечной недостаточности, в то время как модели in vivo сыграли важную роль в разработке препаратов, направленных на снижение интенсивности фиброза, таких как блокаторы рецепторов ангиотензина и ингибиторы АПФ, которые ныне являются стандартом лечения ХБП [61]. В исследованиях заболеваний легких, таких как хроническая обструктивная болезнь легких и астма, модели in vitro, включая легочные эпителиальные клеточные культуры, помогли протестировать новые бронхорасширяющие препараты и противовоспалительные средства, тогда как модели in vivo, основанные на воздействии табачного дыма или на аллергических реакциях, способствовали разработке ингаляторов и биопрепаратов [62]. В исследованиях заболеваний печени модели in vitro помогают выявлять гепатопротекторные препараты и изучать повреждения печени, вызванные лекарствами, тогда как модели in vivo играют важную роль в изучении фиброза и прогрессирования стеатогепатита, что привело к клиническим исследованиям препаратов для лечения цирроза печени [63].

Несомненно, что усиленное внимание к явлению фиброза в патогенезе эндометриоза должно направить исследователей на более современное и реалистичное видение этой патологии, создание более совершенных моделей, проведение фармакологических исследований, призванных повысить успех новых терапевтических средств и подходов к лечению эндометриоза [7, 63, 64]. В настоящее время ведется интенсивный поиск патогенетического лечения эндометриоза, основывающегося на специфическом воздействии на ряд молекул и сигнальных путей. Некоторые гипотезы уже протестированы на животных моделях эндометриоза. К примеру, в исследовании X. Zeng и соавт. использование Csn-В, агониста NR4A1, привело к заметному снижению экспрессии маркеров фиброгенеза in vitro и ингибировало процесс спайкообразования на животных моделях эндометриоза. Важно, что инъекция фрагментов эндометрия проводилась подкожно, а не в яичники, что нерепрезентативно и не отражает изменения, происходящие в яичнике [65]. In vitro выяснено, что ингибировать фиброгенез можно, воздействуя на Wnt/β-катениновый сигнальный путь эндометриоидных стромальных клеток [66]. На мышиной модели эндометриоза показано, что снижение концентрации TGF-β1 привело к уменьшению размера поражений более чем на 90%, а также к снижению количества α-SMA-положительных миофибробластов в эктопических очагах на 47% [67].

Обоснование собственного эксперимента

Известно, что дифференцировка фибробластов в миофибробласты под действием TGF-β1 сопровождается повышенной экспрессией таких маркеров, как α-SMA, коллаген I типа, CCN2 и т.д. Показано также, что экспрессия данных маркеров повышена как в эндометриальных, так и в эндометриоидных стромальных клетках после стимуляции с TGF-β1 [66, 67]. При активации с TGF-β1 миофибробласты проявляют повышенную пролиферацию, миграционную способность, продукцию цитокинов и интерстициального матрикса, что приводит к нарушению функции интактных остаточных тканей, изменению биохимического и биофизического микроокружения и как следствие к развитию фиброза [27]. Более того, миофибробласты начинают сами продуцировать TGF-β1, что еще больше способствует их дальнейшей дифференцировке и активности. Этот порочный круг может привести к чрезмерному и бесконтрольному формированию фиброза. TGF-β1 также индуцирует экспрессию хемокинов, в частности CCL5 в дифференцированных миофибробластах, который способствует привлечению иммунных клеток, последние, в свою очередь, будут способствовать активации миофибробластов [68]. Известно, что для TGF-β1-индуцированной миофибробластной трансформации необходима совместная колокализация на липидных рафтах рецептора для ГК, CD44 и рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), который, как известно, усиливает экспрессию TGF-β1 [69]. Повышенная экспрессия ГК и ее рецептора на клеточной поверхности (CD44) обнаружена при многочисленных фиброзных процессах, связанных с дисфункцией органов.

Ранее показано, что мышиная клеточная линия фибробластов NIH/3T3 при инкубации с TGF-β1 in vitro подвергаются дифференцировке в миофибробласты (начинают экспрессировать α-SMA, коллаген I типа и т.д.) [45—47].

Результаты нашего исследования демонстрируют антифибротический эффект бовгиалуронидазы азоксимер в контексте профилактики и лечения эндометриоз-ассоциированного спаечного процесса. Бовгиалуронидаза азоксимер, являясь ферментным препаратом с выраженной способностью гидролизовать низкомолекулярную ГК, эффективно ингибирует ключевые механизмы, связанные с образованием фиброзной ткани и спаечного процесса, что показано на клеточной модели с применением TGF-β1 — основного медиатора фиброгенеза.

Стимуляция фибробластов TGF-β1 приводила к их дифференцировке в миофибробласты с повышенной экспрессией таких маркеров фиброза, как α-SMA, коллаген I типа и CNN2, что является важным признаком развития фибротического процесса при эндометриозе. Однако применение бовгиалуронидазы азоксимер привело к значительному снижению экспрессии этих маркеров, что свидетельствует о способности препарата подавлять TGF-β1-индуцированный переход фибробластов в миофибробласты и тем самым ограничивать прогрессирование фиброза.

Одним из наиболее важных эффектов стало влияние на метаболическую активность и миграцию фибробластов. В экспериментах показано, что под действием TGF-β1 метаболическая активность фибробластов возрастала, что коррелировало с усилением их пролиферации и миграционной способности. Бовгиалуронидаза азоксимер достоверно снижала эти показатели, подавляя миграцию фибробластов в «рану» и их пролиферативную активность. Данный эффект может быть ключевым в предотвращении образования спаек и снижении интенсивности возможного развития фиброзных изменений при эндометриозе.

Кроме того, бовгиалуронидаза азоксимер оказала влияние на экспрессию CD44 и CCL5 — важных маркеров, связанных с воспалительным и иммунным ответом при фиброзе. Снижение уровня экспрессии этих молекул подтверждает способность воздействовать на ключевые регуляторные пути, поддерживающие хроническое воспаление и фиброгенез.

Заключение

В настоящее время результаты исследований в области эндометриоза связывают данное заболевание с воспалением, приводящим к фиброзу, образованию спаек, болевому синдрому, бесплодию и другим симптомам, снижающим качество жизни.

С целью выявления образования спаек в раннем послеоперационном периоде у больных после реконструктивно-пластических операций на матке, маточных трубах и яичниках Л.В. Адамян и соавт. в 1993 г. на 3—4-е сутки через оставленные в брюшной полости дренажные силиконовые трубки проводили раннюю контрольную лапароскопию и санацию брюшной полости для оценки состояния послеоперационного шва на органах репродуктивной системы, признаков воспаления и развития послеоперационных спаек [70, 71]. Авторами выявлены нити фибрина, повышение васкуляризации наличие перитонеальной жидкости с высоким содержанием макрофагов, что расценивалось как признаки развивающегося спаечного процесса и воспаления, в связи с чем возникала необходимость в раннем антибактериальном, противовоспалительном и восстановительном лечении.

Согласно собственным результатам [2] и данным литературы, наряду с хирургическим и/или гормональным лечением необходимо применение интраоперационных методов профилактики спаек, реабилитации и ранней профилактики фиброза и спаечного процесса у пациенток с эндометриоз-ассоциированной болью и бесплодием. Целесообразно использовать новые подходы, направленные на противоспаечную терапию, основанную на гистологическом подтверждении, для ранней интраоперационной профилактики.

С 2003 г. по настоящее время нами использована экспериментальная животная модель эндометриоза и спаечного процесса [33, 49], что позволило прийти к заключению о необходимости продолжения исследований в области эндометриоза и эндометриоз-ассоциированного бесплодия для создания моделей, воспроизводящих истинный очаг эндометриоза, и новых подходов патогенетически обоснованного лечения. Создание экспериментальных условий, наиболее соответствующих по морфологической структуре очагу заболевания, является обоснованием применения клеточной линии in vitro для оценки эффективности бовгиалуронидазы азоксимер в профилактике и лечении эндометриоз-ассоциированного спаечного процесса.

Таким образом, наше экспериментальное исследование in vitro показало, что бовгиалуронидаза азоксимер обладает выраженным антифибротическим эффектом в модели эндометриоза. Препарат эффективно ингибировал TGF-β1-индуцированную дифференцировку фибробластов в миофибробласты, снижая экспрессию ключевых маркеров фиброза, таких как α-SMA и коллаген I типа. Бовгиалуронидаза азоксимер также уменьшала метаболическую активность и миграцию фибробластов, что предотвращает образование спаек и прогрессирование фиброза. Влияние данного препарата на экспрессию воспалительных маркеров, таких как CD44 и CCL5, свидетельствует о его потенциале в снижении хронического воспаления.

Необходимы дальнейшие исследования для оценки эффективности противоспаечного лечения в экспериментальных и клинических условиях, а также для разработки новых стратегий таргетного лечения, направленных в том числе на коррекцию окислительного стресса, воспаления, предотвращение ферроптоза гранулезных клеток и уменьшение повреждений ДНК. Это позволит предложить более эффективные и патогенетически обоснованные подходы к лечению эндометриоза, что, в свою очередь, может улучшить общее состояние здоровья пациенток, репродуктивные исходы и качество жизни в целом.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.