Введение

Заболеваемость населения Российской Федерации и всего мира злокачественными новообразованиями кожи ежегодно растет. Базально-клеточная карцинома (БКК) — один из наиболее распространенных видов рака кожи во всем мире, что является социально значимой проблемой [1]. Для совершенствования качества организации онкологической помощи современное здравоохранение нуждается в разработке методов неинвазивной экспресс-диагностики новообразований, с помощью которых представляется возможным установить диагноз на стадии инициации злокачественного процесса и принять соответствующие меры [2]. На сегодняшний день в качестве диагностических методов исследования применяются цитологический, гистологический, дерматоскопия и др., что позволяет установить точный диагноз при наличии соответствующего опыта у врача. Однако упомянутые выше методы исследования могут быть либо недостаточно чувствительными, специфичными и точными, либо инвазивными, занимающими длительное время. Неинвазивная визуализация как in vivo, так и ex vivo может служить вспомогательным инструментом в практике врача и дополнением к существующим методам диагностики, а также в перспективе повысить эффективность диагностики и лечения, снизить затраты системы здравоохранения, улучшить качество оказания медицинской помощи и повысить удовлетворенность пациентов [1, 3—5]. Предложено большое количество методов диагностики, используемых в онкологии [1, 3, 4, 6—9], но для обеспечения в полной мере эффективности раннего выявления опухолевых заболеваний необходима разработка специальных алгоритмов. Соответственно, следует обратить внимание на использование неинвазивных методов исследования [10, 11], таких как конфокальная микроскопия, высокочастотный ультразвук, оптическая когерентная томография, комбинационное рассеяние света и флюоресцентная микроспектроскопия и др., которые позволят клиницисту установить точный диагноз в экспресс-режиме для лечения новообразований кожи на ранней стадии [6—9, 12—16].

Эффекты комбинационного рассеяния света и флюоресценции зарекомендовали себя в качестве перспективных методов в ранней диагностике опухолевых заболеваний, при этом каждый из них имеет свои преимущества и недостатки, однако лишь при использовании комбинированных оптических технологий, а также при условии соответствующей подготовки специалистов представляется возможным проводить точную, высокочувствительную, высокоспецифичную диагностику. Использование неинвазивной оптической визуализации как in vivo, так и ex vivo может повысить эффективность диагностики и хирургического лечения рака кожи, в том числе для четкого определения границ резекции опухолевой ткани, при этом в режиме реального времени представляется возможным in vivo контролировать наличие фрагментов ткани, пораженной злокачественным процессом [17].

Цель исследования — осуществить экспериментальное обоснование к разработке метода ранней неинвазивной дифференциальной экспресс-диагностики новообразований кожи с использованием 2D-сканирующей конфокальной микроспектроскопии фотолюминесценции и комбинационного рассеяния света для повышения качества организации онкологической помощи.

Преимуществами данного комбинированного метода являются его неинвазивность, скорость, точность, высокие чувствительность и специфичность, а также возможность проводить дифференциальную диагностику новообразований кожи [6, 18]. Исследование является пилотным.

Материал и методы

В ходе исследования проанализировано 62 спектра БКК кожи. Исследование проведено на удаленном материале in vitro с использованием 2D-сканирующей конфокальной микроспектроскопии фотолюминесценции и комбинационного рассеяния света на длине волны возбуждающего лазерного излучения 532 нм. В ходе исследования проанализированы спектры образцов, полученных после хирургического лечения рака кожи (БКК). Стадия заболевания соответствовала символу T1N0M0. Диагноз верифицирован морфологически. Во всех случаях выполнялось радикальное хирургическое вмешательство, которое носило лечебный характер. Лечение проводилось в специализированном отделении онкологии. Диагностика, терапия и последующее диспансерное наблюдение пациентов осуществлялись в соответствии с клиническими рекомендациями. С момента взятия образцов до начала исследований проходило не более 1,5 ч. Чашку Петри с исследуемым небольшим фрагментом ткани размерами до 3×3 мм, который включал в себя участок БКК головы и шеи в пределах интактной ткани вокруг, размещали на столике сканирующего рамановского конфокального микроскопа Confotec MR520 («SOL Instruments», Республика Беларусь) со следующими характеристиками: длина волны возбуждающего лазерного излучения 532 нм; ширина линии 0,1 нм; полоса регистрации 500 нм; пространственное разрешение 0,5 мкм; охлаждение сенсора –20 °C. Образцы исследовали с использованием диафрагмы 50 мкм, решетки 600 нм. Устанавливали уровень мощности лазерного пучка 10%, что соответствовало 2,2 мВт при диаметре 1,1 мм. Такой уровень мощности обеспечивал отсутствие какого-либо деструктивного воздействия лазерного излучения на изучаемые биологические ткани. При этом для повышения чувствительности и отношения сигнал/шум устанавливали время накопления сигнала для каждой точки исследования 10 с. После настройки параметров исследования в поле зрения микроскопа выбирали область образца и снимали спектры фотолюминесценции и комбинационного рассеяния света.

Проведение исследования одобрено межвузовским комитетом по этике (выписка из протокола №3 от 16.03.23).

Результаты

В ходе исследования получены спектры фотолюминесценции и комбинационного рассеяния света БКК и кожи вокруг опухоли in vitro при возбуждении на длине волны 532 нм, а также результаты оценки состояния морфологической структуры новообразований кожи, полученные с использованием этого метода. Приведено экспериментальное обоснование к определению взаимосвязи сканирующей конфокальной микроспектроскопии фотолюминесценции и комбинационного рассеяния света с данными патоморфологического исследования.

Как показано на рис. 1, 2, наиболее значимыми полосами комбинационного рассеяния света при БКК являются 1012 (диапазон волновых чисел 903—1131); 1312 (1131—1375); 1452 (1375—1583); 1662 (1583—1750); 2930 (2875—3062 см^–1) см^–1, что коррелирует с данными мировой литературы [8, 12—14] и может быть использовано в дальнейшем в качестве диагностического критерия.

Рис. 1. Спектр комбинационного (рамановского) рассеяния базально-клеточной карциномы кожи при накачке лазером с длиной волны 532 нм.

По оси абсцисс — величины волновых чисел в обратных сантиметрах; по оси ординат — интенсивность в абсолютных единицах.

Рис. 2. Нормализованные спектры комбинационного (рамановского) рассеяния базально-клеточной карциномы кожи и ткани вокруг опухоли — границы резекции базально-клеточной карциномы кожи при накачке лазером с длиной волны 532 нм.

Обсуждение

В клинической медицине перспективными являются такие неинвазивные методы визуализации рака кожи, как цифровая фотография, дерматоскопия, ультразвуковое исследование (сонография), отражательная конфокальная микроскопия, оптическая когерентная томография, методы электрического импеданса, спектроскопия комбинационного рассеяния, мультиспектральная визуализация, флюоресцентная визуализация и мультиспектральная оптоакустическая томография. Каждый из методов имеет свои преимущества и недостатки [19—21]. Использование сканирующей конфокальной микроспектроскопии фотолюминесценции и комбинационного рассеяния света позволит врачам в будущем проводить раннюю неинвазивную диагностику опухолевых заболеваний [19]. Так, в клинической медицине известна микрографическая хирургия Мооса, которая позволяет удалить фрагменты ткани, пораженные злокачественным процессом, максимально точно, с сохранением краев резекции в области интактной ткани [17, 22]. Учеными описано определение возможностей спектроскопии для проведения неинвазивной диагностики рака кожи in vivo с получением спектров флюоресценции и комбинационного рассеяния света [23, 24]. Некоторые модификации микроспектроскопии комбинационного рассеяния и фотофлюоресценции, основанные на функционировании цифрового микрозеркального устройства, позволяют в режиме реального времени определять границы резекции опухолевой ткани при новообразованиях кожи [25]. Помимо морфометрических характеристик, важным является определение уровня химических компонентов в тканях кожи [26], что позволяет рассматривать метод не только с целью раннего выявления опухолевого процесса в тканях кожи, но и для осуществления мониторинга проведенной терапии. При оценке биомаркеров, регистрирующихся при новообразованиях кожи, описаны основные полосы комбинационного рассеяния света, специфичные для содержания различных компонентов ткани. Микроспектроскопия фотолюминесценции и комбинационного рассеяния света может использоваться для диагностики злокачественной меланомы и базально-клеточного рака также in vivo [27, 28]. Стопроцентная точность дифференциации доброкачественных и злокачественных новообразований кожи возможна только при комбинированном анализе сигналов комбинационного рассеяния света и флюоресценции [29]. Микроспектроскопия комбинационного рассеяния света в сочетании с фоновой аутофлюоресценцией в ближней инфракрасной области может быть информативной при оценке особенностей злокачественного поражения тканей in vivo [30], в том числе молекулярной структуры тканей [27].

Мультимодальная спектральная гистопатология — оптический метод, сочетающий в себе аутофлюоресценцию тканей и микроспектроскопию комбинационного рассеяния света, которые могут быть использованы в перспективе при хирургическом лечении БКК [31]. С целью дифференциации тканей при БКК и меланоме, в том числе от интактной ткани, в литературе описано использование спектроскопии комбинационного рассеяния с длиной волны 830 нм [32], однако в проведенном нами исследовании показано, что длина волны 532 нм также является информативной в отношении дифференциации тканей при БКК. Специфичность при использовании эффекта комбинационного рассеяния света в отношении дифференциальной диагностики опухолевых заболеваний кожи может применяться в качестве массового скрининга и мониторинга течения кожной патологии [13]. Метод комбинационного рассеяния света в сочетании с эффектом флюоресценции обеспечивает получение усиленных рамановских сигналов от биомолекул с последующей оценкой изменения химического состава нативных биомаркеров, таких как триптофан, каротиноиды, липиды и белки. При БКК отмечается выраженное увеличение белков, включая коллаген типа I в сочетании с амидом I и аминокислотами, и снижение содержания каротиноидов и липидов. Инфракрасная спектроскопия с длинами волн 671, 785, 830 или 1060 нм может иметь ограничения для практического применения [8]. Однако, по нашему мнению, с помощью специального алгоритма диагностики представляется возможным анализировать изменения, происходящие в тканях, при проведении спектрального анализа (как рамановской, так и флюоресцентной составляющей). При этом на различных длинах волн можно получить определенную информацию о биологическом объекте, что и является целью дальнейших исследований в данной области. Определенные биомолекулы в клетке и органеллах содержат флюорофоры, такие как флавины, НАДН, НАД, коллагены, эластин, каротиноиды, триптофан, гемопротеины, митохондрии и цитохромы, которые могут способствовать появлению специфических пиков, а также сигналов флюоресценции, различных в норме и при БКК. При этом следует обратить внимание на необходимость оценки спектральных особенностей ткани в норме и при патологии на различных длинах волн в динамике с расчетом специальных индексов (в том числе величин отношения длин волн друг к другу), демонстрирующих изменения, происходящие в них. Спектральные изменения характеристик БКК отмечаются при величинах волновых чисел 1012, 1452, 1662, 2861, 2898 и 2932 см^–1 [8], что коррелирует с результатами проведенного нами исследования.

Заключение

Проведение первого экспериментального этапа исследования является важным для разработки метода ранней неинвазивной диагностики БКК кожи. Высокую научную значимость имеет верифицированная база 2D-карт спектров фотолюминесценции и комбинационного рассеяния света, коррелирующих с данными патоморфологического исследования. Практическая значимость полученных результатов связана с решением чрезвычайно актуальной социально значимой проблемы ранней неинвазивной экспресс-диагностики БКК кожи. Несвоевременная или неэффективная диагностика опухолевых заболеваний обусловливает необходимость проведения более обширных операций, что существенно снижает качество жизни больных. Кроме того, возрастают финансовые затраты на лечение и реабилитацию пациентов с онкологическим заболеваниями, обнаруженными на поздней стадии. В ходе экспериментального обоснования отработана методика исследования образцов тканей, подтверждена возможность дифференциации злокачественных и интактных тканей методами конфокальной микроспектроскопии фотолюминесценции и комбинационного рассеяния света на примере БКК кожи. Разрабатываемый метод в перспективе позволит существенно повысить эффективность ранней неинвазивной экспресс-диагностики новообразований кожи, обеспечить мониторинг проводимого лечения и, соответственно, улучшить качество организации онкологической помощи.

Участие авторов: концепция, основная идея, методология и дизайн исследования — А.Б. Тимурзиева, Е.Н. Римская, сбор и обработка материала — А.Б. Тимурзиева, М.В. Рябов, В.А. Дуванский, Е.Н. Римская, С.Н. Шелыгина, К.Г. Кудрин; статистический анализ данных — А.Б. Тимурзиева, Е.Н. Римская, С.Н. Шелыгина; написание текста — А.Б. Тимурзиева; редактирование — А.Б. Тимурзиева, Е.Н. Римская, К.Г. Кудрин.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда, проект №23-25-00249.

This research was funded by Russian Science Foundation, grunt number №23-25-00249.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.