Введение
Проблема преждевременных родов (ПР), отличающихся высокими перинатальной заболеваемостью и смертностью, остается весьма актуальной в современном акушерстве [1—3]. Это обусловливает необходимость дальнейшего исследования молекулярных причин, приводящих к преждевременному развитию родовой деятельности, что будет способствовать совершенствованию современных методов его прогнозирования [4].
Формирование и дальнейшее развитие беременности во многом зависит от функционирования системы мать—плацента—плод, в которой важное место занимает плацента. Для ее химического состава, как и многих эмбриональных тканей, характерно высокое содержание нуклеиновых кислот — активных компонентов клеточного протеосинтеза. Значительную роль в плаценте играет также метаболизм структурных компонентов нуклеиновых кислот — нуклеотидов [5]. Ациклические нуклеотиды (аденозинтрифосфорная кислота — АТФ, аденозиндифосфорная кислота — АДФ, аденозинмонофосфорная кислота — АМФ) участвуют прежде всего в регуляции нормального энергообеспечения плаценты, и, как следствие, всего фетоплацентарного комплекса [6]. Более многочисленные функции выполняют циклические нуклеотиды (цАМФ и циклическая гуанозинмонофосфорная кислота — цГМФ), которые рассматриваются как вторичные мессенджеры (передатчики) в системе поступления информации от внешнего (первичного) сигнала к соответствующим рецепторам. Регуляторное действие циклических нуклеотидов осуществляется с помощью ферментов протеинкиназ, влияющих на свойства очень большого количества белков различных субклеточных фракций [7]. В связи с этим модификация активности протеинкиназ сопровождается нарушением многих метаболических реакций.
В свою очередь интенсивность продукции нуклеотидов может регулироваться различными медиаторами, особое место среди которых занимают газотрансмиттеры: оксид азота (NO), оксид углерода (CO), сероводород (H2S). Они оказывают фундаментальное влияние на состояние клеточных функций в качестве регуляторов систем внутри- и межклеточной сигнализации и коммуникации [8—10]. Выяснение их взаимосвязи с нуклеотидами плаценты поможет уточнить молекулярные механизмы изменения содержания и обмена как циклических, так и ациклических нуклеотидов, и их структурных компонентов.
Цель исследования — изучение обмена нуклеотидов и клеточных газотрансмиттеров в плаценте для выяснения их роли в патогенезе ПР.
Материал и методы
В проспективное исследование были включены 55 женщин в возрасте от 23 до 33 лет, составивших две группы. В контрольную группу вошли 27 клинически здоровых женщин с неосложненным течением беременности и родами в срок (39—40 нед). Основную группу составили 28 женщин, у которых развилась спонтанная родовая деятельность в сроке беременности 34—37 нед. По возрасту, индексу массы тела, социально-экономическому уровню жизни, соматическому и акушерско-гинекологическому анамнезу, а также по факторам угрозы развития ПР пациентки обследуемых групп были сопоставимы. С помощью ультразвукового исследования с цервикометрией трансвагинальным доступом измерялась длина шейки матки, которая у всех беременных была больше 25 мм. В обеих группах преобладали первородящие: в основной группе они составили 60,7%, в контрольной — 62,9%. В анамнезе прерывание беременности по желанию женщин было в 23,2 и 21,5% случаев соответственно в основной и контрольной группах. Из исследования исключались пациентки с тяжелой экстрагенитальной и генитальной патологией, воспалительно-инфекционными процессами, беременностью, наступившей в результате применения вспомогательных репродуктивных технологий, с аутоиммунной патологией и не дававшие информированное согласие на расширенный протокол обследования.
Материалом для исследования служила ткань плаценты, взятая сразу после родов при соблюдении холодового режима (температура 2—4 °C). В безбелковых экстрактах плаценты определяли содержание ациклических нуклеотидов и нуклеозидов с помощью коммерческих наборов UV-test Boehringer Mannheim Gmb HDiagnostica (Германия). Об активности ферментов обмена нуклеотидов и нуклеозидов судили по данным спектрофотометрических методов исследования в ультрафиолетовой зоне спектра [5, 6]. Активность циклонуклеотидзависимых протеинкиназ (ПК) оценивали по включению радиоактивного фосфора в белки из [g-32P]АТФ [11]. Содержание субстратов этих реакций: цАМФ и цГМФ определяли радиоиммунологическим методом с помощью соответствующих коммерческих наборов Sigma (США), используя сцинтилляционный счетчик.
Активность фермента, ответственного за синтез газотрансмиттера H2S — цистатионин-b-синтазы — определяли путем иммуноферментного анализа с использованием тест-наборов CloudClaneCorp. (США). Об интенсивности генерации газотрансмиттера CO судили по активности фермента гистидиндекарбоксилазы [12]. Активность NO-синтазы измеряли по увеличению продукции NO из аргинина в присутствии НАДФН (никотинамидадениндинуклеотидфосфат) [13].
Статистическую обработку полученных данных проводили, используя пакет программ Statistica 6.0 («StatSoft. Inc.», США). Степень соответствия данных нормальному распределению оценивали с помощью критерия Шапиро—Уилка. Статистическую значимость различий между сравниваемыми показателями определяли по критерию Стьюдента (t-критерий). Корреляционный анализ выполнен с использованием критерия Пирсона с расчетом коэффициента корреляции (r). Результаты оценивали как статистически значимые при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Полученные данные свидетельствуют, что при ПР происходят нарушения продукции и обмена нуклеотидов и их структурных компонентов (табл. 1).
Таблица 1. Содержание ациклических, циклических нуклеотидов и активность ферментов их обмена в плаценте при родах в срок и преждевременных родах (M±m)
| Показатель | Роды в срок | ПР |
| АТФ, мкг/г ткани | 2,83±0,18 | 1,84±0,13** |
| АДФ, мкг/г ткани | 2,41±0,17 | 1,61±0,011** |
| АМФ, мкг/г ткани | 1,27±0,09 | 1,81±0,14* |
| Аденин, мкг/г ткани | 234,1±16,8 | 310,8±21,4* |
| Аденозин, мкг/г ткани | 76,3±6,61 | 38,9±3,85** |
| Адениндезаминаза, нмоль/мг белка | 0,58±0,04 | 0,38±0,03** |
| Аденозиндезаминаза, нмоль/мг белка | 1,72±0,14 | 2,43±0,19* |
| 5’-нуклеотидаза, нмоль/мг белка | 0,72±0,06 | 0,42±0,03** |
| цАМФ, нмоль/г ткани | 412,3±31,1 | 259,4±19,9** |
| Аденилатциклаза, нмоль/мг белка | 276,2±21,2 | 168,3±12,1** |
| Фосфодиэстераза, нмоль/мг белка | 60,11±4,15 | 84,92±6,71** |
| цАМФ-протеинкиназа, имп/с/мг белка | 41,62±2,91 | 26,81±1,87* |
| цГМФ, нмоль/г ткани | 20,73±1,35 | 15,82±0,97* |
| Гуанилатциклаза, нмоль/мг белка | 14,22±0,84 | 11,03±0,67* |
| цГМФ-протеинкиназа, имп/с/мг белка | 15,61±0,92 | 11,32±0,69** |
Примечание. Здесь и в табл. 2: статистическая значимость различий между показателями основной и контрольной групп: * — p<0,01, **— p<0,001.
Причем изменения касаются как ациклических, так и, что особенно важно, циклических нуклеотидов. Значительное отклонение отмечено для основного макроэрга — АТФ, содержание которого снижается на 35,0% относительно контрольной величины. Аналогичные степень и направленность изменения установлены и для АДФ (уменьшение на 33,1%). В то же время количество АМФ увеличивается на 42,6%, что приводит к соответствующему снижению отношения АДФ/АМФ. Определенный вклад в этот процесс вносит снижение активности 5’-фосфодиэстеразы. Установленный дисбаланс аденинфосфонуклеотидов, несомненно, снижает энергопоступление в плаценту и сопровождается развитием кислородной недостаточности. Почти на 50% снижается и уровень нуклеозида аденозина, в результате прежде всего уменьшения активности 5’-нуклеотидазы и повышения активности аденозиндезаминазы. Уменьшение при ПР содержания аденозина также может усиливать нарушение кислородного обеспечения плацентарной ткани, поскольку он является активным регулятором кровотока. Значительно ниже контрольных показателей находится также активность адениндезаминазы — наиболее важного фермента пуринового обмена. Это приводит к накоплению аденина (см. табл. 1), повышенное содержание которого как следствие его цитостатических возможностей, по-видимому, нарушает различные клеточные реакции [5].
Ранее проведенные нами исследования показали, что среди сложных белков плаценты, в состав которых входят небелковые компоненты, большая доля принадлежит ациклическим нуклеопротеинам, причем при осложненной гестации содержание их снижается, что особенно выражено в митохондриальных структурах, ответственных за процессы генерации энергии [14]. Такая динамика подтверждается данными, полученными в настоящей работе, также свидетельствующими о возможности падения энергетического потенциала клеток в результате нарушения метаболизма различных нуклеотидов.
Поскольку функционирование плаценты на клеточном уровне зависит от внешних регуляторных сигналов: гормонов, факторов роста, интерлейкинов, не действующих, как правило, непосредственно на метаболические процессы, роль вторичных передатчиков, запускающих внутриклеточные реакции, особенно важна. Среди последних большое значение имеют цАМФ и ферменты, регулирующие его синтез и распад [15]. Следует отметить, что цАМФ тем или иным образом опосредует действие многих гормонов, в том числе стероидных, а также простагландинов.
Как показали наши исследования, содержание цАМФ при угрозе ПР снижено на 37,1%, активность аденилатциклазы уменьшена в аналогичной степени, а фосфодиэстеразы повышена примерно на 40% (см. табл. 1). Установленная направленность изменения активности этих ферментов объясняет снижение уровня циклического нуклеотида и, следовательно, уменьшение эффективности его регуляторных возможностей [16—18].
Наряду с активностью ферментов, контролирующих количество циклических нуклеотидов, большое значение имеют протеинкиназы, ответственные за результативность работы этих нуклеотидов. Фосфорилирование тканеспецифических белков — субстратов протеинкиназ — является главным механизмом действия циклических нуклеотидов, особенно цАМФ. При преждевременном развитии родовой деятельности активность цАМФ-протеинкиназы снижена в плаценте на 35,7%. Для цГМФ и активности ферментов обмена этого циклонуклеотида (гуанилатциклазы и цГМФ-протеинкиназы) нарушения менее выражены. Их содержание снижено в среднем на 22—25% относительно нормы. В связи с этим их влияние на плацентарный метаболизм, очевидно, менее значимо, однако тоже вносит определенный вклад в модификацию широкого спектра регуляторных процессов на клеточном и субклеточном уровнях. К числу серьезных последствий посттрансляционной деструкции (фосфорилирования) различных групп белков относятся повреждения ядерных, митохондриальных, цитоплазматических и мембранных белков с их специфическими функциями.
В свою очередь биологические эффекты нуклеотидов и ферментов их обмена, особенно протеинкиназ, могут регулироваться другими медиаторами по принципу обратной связи. Проведенные нами исследования ферментов обмена трех основных газотрансмиттеров — NO, CO и H2S выявили достоверное уменьшение активности NO-синтазы, гистидиндекарбоксилазы и цистатионин-b-синтазы в плаценте (табл. 2).
Таблица 2. Активность ферментов обмена газотрансмиттеров в плаценте при родах в срок и преждевременных родах (M±m)
| Показатель, нмоль/мг белка | Роды в срок | Преждевременные роды |
| NO-синтаза | 5,65±0,41 | 3,04±0,22** |
| Гистидиндекарбоксилаза | 0,95±0,06 | 0,70±0,05* |
| Цистатионин-b-синтаза | 0,064±0,003 | 0,048±0,002* |
Снижение составляет 46, 26,4 и 25% соответственно. Кроме того, уменьшается уровень стабильных метаболитов оксида азота (NO2–, NO3–) на 45,2% и значительно снижается количество образованного H2S. С помощью корреляционного анализа установлена взаимозависимость между рядом показателей активности ферментов обмена нуклеотидов и газотрансмиттеров. Позитивная корреляция выявлена между концентрацией NO-синтазы и уровнем цАМФ, активностью цАМФ-протеинкиназы, аденилатциклазы (r=0,85; r=0,83; r=0,84; p<0,01 соответственно). Для гистидиндекарбоксилазы коэффициенты корреляции с перечисленными показателями циклонуклеотидного обмена составили r=0,80; r=0,81; r=0,83; p<0,01. Определенная корреляция имеется также между содержанием цистатионин-b-синтазы и теми же параметрами нуклеотидного обмена (r=0,82; r=0,83; r=0,80; p<0,01).
Такая тесная корреляция подчеркивает роль влияния многофункциональных газотрансмиттеров на важные участки нуклеотидного, особенно циклонуклеотидного, обмена с последующим воздействием на процессы плацентации, пролиферации, клеточной дифференцировки, стероидогенеза, синтеза простагландинов [19, 20]. Нарушение этих процессов в результате модификации активности ферментов обмена газотрансмиттеров и их опосредованного влияния на обмен циклонуклеотидов, особенно цАМФ-нуклеотидов, очевидно, будет создавать предпосылки для преждевременного развязывания родовой деятельности.
Анализируя в целом полученные результаты, можно констатировать, что дисбаланс нуклеотидного обмена в плаценте, усиленный повреждением продукции регуляторных газотрансмиттеров, очевидно, приводит к невозможности пролонгирования беременности.
Заключение
Резюмируя данные настоящего исследования, можно сделать вывод, что при ПР происходят значительные нарушения в обмене различных нуклеотидов и их активных регуляторов — газотрансмиттеров. Из числа ациклических нуклеотидов наибольшее снижение содержания установлено для основного макроэрга — АТФ и ферментов его обмена, особенно 5’-нуклеотидазы. Разнонаправленные изменения выявлены и для уровня структурных компонентов нуклеотидов: нуклеозидов и пуриновых оснований. Различная степень отклонений наблюдается для показателей циклических нуклеотидов, а также ферментов их синтеза и распада.
Результативность действия циклических нуклеотидов на обменные процессы, прежде всего обмен белков, регулируется активными мессенджерами — газотрансмиттерами, продукция которых в плаценте при преждевременном развитии родовой деятельности уменьшается. Взаимодействие всех этих повреждений структурных компонентов нуклеиновых кислот, ответственных за процессы клеточной дифференциации, пролиферации, апоптоза и в целом за функционирование плаценты, очевидно, приводит к нарушению формирования, течения беременности и ее исходу. Выявленные изменения на фоне плацентарного дисбаланса газотрансмиттеров могут быть важными звеньями в цепи молекулярно-клеточных повреждений при развитии преждевременного прерывания гестации.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Т.Н. Погорелова, И.И. Крукиер
Сбор и обработка материала — Н.А. Друккер, А.А. Никашина
Статистическая обработка — И.И. Крукиер, В.В. Авруцкая
Написание текста — Т.Н. Погорелова, Н.В. Палиева, Н.А. Друккер
Редактирование — Т.Н. Погорелова, М.А. Левкович, В.В. Авруцкая
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Participation of authors:
Concept and design of the study — T.N. Pogorelova, I.I. Krukier
Data collection and processing — N.A. Drukker, A.A. Nikashina
Statistical processing of the data — I.I. Krukier, V.V. Avrutskaya
Text writing — T.N. Pogorelova, N.V. Palieva, N.A. Drukker
Editing — T.N. Pogorelova, M.A. Levkovich, V.V. Avrutskaya
Authors declare lack of the conflicts of interests.