Нестероидные противовоспалительные средства (НПВС) относятся к числу наиболее широко применяемых в медицинской практике лекарственных препаратов. НПВС используются в медицинской практике разных стран при воспалительных заболеваниях и для снятия болевых синдромов [1]. Такие препараты должны отпускаться из аптечных учреждений по назначению и рецепту врача (приказ МЗ РФ № 110 от 12.02.07), однако в РФ их легко можно приобрести без рецепта. Таким образом, возрастает число случаев самолечения данными препаратами, бесконтрольного их применения, что может способствовать увеличению случаев передозировок и приводить к отравлениям.

Для НПВС характерен ряд побочных эффектов: ульцирогенность, нефро- и гепатотоксичность, реакции гиперчувствительности, бронхоспазм и др. [2], которые могут вызывать серьезные последствия при применении. Проблема осложнений при терапии НПВС является чрезвычайно актуальной в связи с необходимостью применения этих препаратов длительно (часто пожизненно). Известны случаи смертельных отравлений при введении препаратов НПВС в дозах, превышающих максимальные терапевтические. Наибольшей опасности последствий токсического воздействия НПВС подвержены дети и лица пожилого возраста [1].

Обращает на себя внимание тот факт, что НПВС входят в состав большого количества комбинированных лекарственных средств, активно применяются населением и вследствие этого при судебно-химических исследованиях встречаются в значительном количестве биологических объектов. Согласно статистике судебно-химического отделения Пермского краевого бюро судебно-медицинской экспертизы, за период 2012—2013 гг. НПВС обнаружили в 10% исследований трупного материала.

Описана возможность выявления и идентификации шести НПВС (ибупрофен, диклофенак, кеторолак, индометацин, напроксен и кетопрофен) непосредственно в процедуре скрининга на наркотические и лекарственные вещества в крови с помощью твердофазной экстракции и газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием [3].

Количественная оценка и идентификация важных с токсикологической точки зрения веществ оговорены в п. 87.2 Приказа № 346н Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 12.05.10 «Об утверждении Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных экспертных учреждениях Российской Федерации» как основные задачи судебно-химических исследований. В соответствии с п. 87.9.5 настоящего Приказа все методы количественного определения должны быть апробированы на той биологической матрице, которая будет использоваться для анализа. В связи с этим актуально количественное определение НПВС в крови как наиболее частого объекта в экспертной практике с использованием методики скринингового установления лекарственных и наркотических веществ.

Таким образом, исследование НПВС в контексте скрининга лекарственных и наркотических средств для оценки их концентрации на уровне токсические/терапевтические представляется актуальной задачей для целей экспертной практики.

Цель исследования — изучение возможности количественной оценки некоторых НПВС (ибупрофен, кеторолак, диклофенак, индометацин, напроксен и кетопрофен) методом хромато-масс-спектрометрии в крови в рамках скрининга наркотических и лекарственных веществ.

Оборудование. Для газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) использовали газовый хроматограф Agilent 7820, масс-селективный детектор Agilent 5975 Agilent, США: колонка капиллярная НР-5MS, внутренний диаметр 0,25 мм, длина 30 м, толщина пленки 0,25 мкм. Для твердофазной экстракции (ТФЭ) применяли систему с вакуумной камерой на 12 позиций (Supelico), насос низкого вакуума AIR CADET (США), картриджи Sampli Q Evidex — 200 мг—3 мл Agilent (США), термоблок ПЭ-4030, одноканальный испаритель ПЭ-2300, микровстряхиватель ПЭ-2 (ОАО «Экрос», Россия), полуавтоматические пипетки-дозаторы, позволяющие отбирать объемы жидкостей 4—40, 40—200 мкл и 0,2—1,0, 1—5 мл.

Материалы. Рабочие спиртовые растворы ибупрофена, напроксена, кетопрофена, диклофенака, кеторолака, индометацина, гексенала готовили из лекарственных препаратов; буферный раствор — 1/15 М фосфатный буфер, рН 4,8; азот (о.с.ч.), гелий (о.с.ч.); все используемые растворители и реактивы градации «х.ч.».

Рабочий спиртовой раствор смеси стандартов НПВС готовили с содержанием ибупрофена и напроксена в концентрации 0,2 мг/мл, кетопрофена, диклофенака, кеторолака и индометацина в концентрации 0,1 мг/мл. Для построения градуировочного графика использовали образцы крови с концентрацией 8, 16, 32, 56, 80 мкг/мл для ибупрофена и напроксена; 4, 8, 16, 28, 40 мкг/мл — для индометацина, кетопрофена, диклофенака и кеторолака. Для проведения валидационного исследования готовили образцы крови с концентрацией 10, 40, 60 мкг/мл — для ибупрофена и напроксена; 5, 20, 30 мкг/мл — для индометацина, кетопрофена, диклофенака и кеторолака.

Подготовка проб. Образцы крови для исследования готовили с использованием твердофазной экстракции (ТФЭ) с учетом модификации [3, 4]. К образцам крови объемом 500 мкл добавляли по 50 мкл раствора внутреннего стандарта (спиртовой раствор гексенала — 200 мкг/мл), 2 мл 1/15 М фосфатного буфера, рН 4,8. Флаконы плотно укупоривали и помещали в ультразвуковую баню на 5 мин. Содержимое флаконов центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин, центрифугат отделяли от осадка. Далее проводили ТФЭ по схеме: кондиционирование сорбента осуществляли последовательным промыванием 2 мл 95% этанола и 2 мл 1/15 М фосфатного буфера, рН 4,8. Загрузку анализируемого образца крови осуществляли со скоростью 1 мл/мин, после чего промывали сорбент последовательным пропусканием через него 1 мл 1/15 М фосфатного буфера, рН 4,8 и 1 мл 10% этанола. Сушили патрон под вакуумом в течение 20 мин. Элюирование осуществляли смесью этилацетат—н-гексан (1:2) дважды порциями по 2 мл. Элюат испаряли досуха в токе азота при температуре 40 ^оС.

Дериватизация. К сухому остатку элюата прибавляли 500 мкл безводного ацетона, замывали стенки флакона и переносили раствор в виалу, содержащую 20—25 мг безводного калия карбоната. Добавляли в виалу 40 мкл йодида метила, герметично закрывали и нагревали при температуре 60 °C в течение 1 ч в термоблоке. Виалу охлаждали, отбирали жидкую фазу реакционной смеси, переносили в чистую виалу и испаряли в токе азота при комнатной температуре. Сухой остаток растворяли в 200 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводили в инжектор хромато-масс-спектрометра.

Режим работы газового хроматографа с масс-селективным детектором. Скорость потока газа-носителя (гелий) через колонку 1,5 мл/мин, режим работы split/splitless (деление потока 15:1 с задержкой включения 1 мин после ввода пробы). Температура испарителя хроматографа и интерфейса детектора задавалась 250 и 280 ^оС; температура колонки начальная 70 ^оС в течение 2 мин и прогрев до 280 ^оС со скоростью программирования 20°/мин; выдержка при конечной температуре 8 мин. Напряжение на умножителе масс-селективного детектора устанавливали равной величине автоматической настройки детектора. Регистрация масс-спектров для метильных производных проводилась в режиме полного сканирования ионов в интервале масс 42—450 а.е.

В табл. 1 приведены время удерживания метилированных НПВС и внутреннего стандарта, характеристические ионы, площадь которых использовалась для количественного определения, и соотношение сигнал/шум для нижней калибровочной точки.

Для идентификации и количественного определения компонентов проб хроматограммы обрабатывали с использованием программ AMDIS (The Automatic Mass Spectral Deconvolution and Identification System, NIST) и ChemStation G1701DA, статистическую обработку проводили с помощью программы МS Excel.

Метрологическая оценка методики количественного определения шести НПВС в модельных образцах крови с использованием ТФЭ и ГХ—МС проводилась по восьми статистическим параметрам: µ — принятое опорное значение содержания НПВС в крови; f — число степеней свободы; S² — величина дисперсии, характеризующая степень разброса результатов вокруг среднего значения; S — стандартное отклонение, Sx,% — стандартное отклонение среднего результата, или коэффициент вариации; Дx — полуширина доверительного интервала среднего значения; е — относительная погрешность среднего результата; д — систематическая ошибка методики [5, 6]. Результаты представлены в табл. 2.

Вследствие того, что в ходе исследования |µ—xcр| >0 для каждого количественного уровня НПВС в крови, необходимо выявить наличие или отсутствие систематической ошибки определения. Для образцов модельной крови рассчитывали величину систематической ошибки д в процентах.

Из приведенных расчетных метрологических характеристик очевидно, что полученные результаты количественного анализа образцов крови, содержащих 5 мкг ибупрофена, 2,5 мкг диклофенака, 10 мкг кетопрофена, 30  мкг напроксена и кеторолака во всех приведенных количественных уровнях отягощены систематической ошибкой. Эта ошибка значительна для всех образцов с кеторолаком и ибупрофеном на уровне 5 мкг. Для образцов, содержащих диклофенак, кетопрофен и напроксен в приведенных количественных уровнях, ошибка незначительна. Для индометацина и остальных количественных уровней данных веществ полученные результаты не отягощены систематической ошибкой.

Такой результат для кеторолака можно объяснить его несколько отличными от других пяти НПВС физико-химическими свойствами и, как следствие, неоптимальными условиями пробоподготовки в рамках скрининговой методики.

Определение специфичности методики проводили с помощью ГХ—М.С. Хроматограмма модельной смеси шести НПВС в режиме полного сканирования ионов приведена на рис. 1.

Модельная смесь представляет собой не индивидуальное вещество, а смесь шести НПВС, поэтому добиться наглядного разделения хроматографических пиков не представляется возможным. В связи с этим для определения специфичности прибегли к сравнению масс-спектров пиков метиловых эфиров ибупрофена, напроксена, кетопрофена, диклофенака, кеторолака, индометацина с библиотечными спектрами метиловых эфиров соответствующих НПВС.

Также были построены хроматографические профили по трем основным характеристическим ионам метиловых эфиров шести рассматриваемых НПВС, доказывающие гомогенность хроматографических пиков для каждого НПВС. На примере ибупрофена на рис. 2 приведено сравнение масс-спектра пика метилового эфира ибупрофена с библиотечным масс-спектром. На рис. 3 представлен хроматографический профиль по характеристическим ионам метилового эфира ибупрофена.

Из полученных данных следует, что данная методика количественного определения ряда НПВС специфична и позволяет достоверно определять ибупрофен, напроксен, кетопрофен, диклофенак, кеторолак и индометацин в крови.

Изучение линейности проводили на 5 уровнях концентрации — 8, 16, 32, 56, 80 мкг/мл для ибупрофена и напроксена; 4, 8, 16, 28, 40 мкг/мл для индометацина, кетопрофена, диклофенака и кеторолака методом хромато-масс-спектрометрического определения НПВС в образцах модельной крови после твердофазной экстракции. Критерий приемлемости — коэффициент корреляции не ниже 0,99. Коэффициенты регрессионной прямой вида y = b Ч x + a, рассчитаны для шести НПВС методом наименьших квадратов.

На основании проведенных расчетов можно утверждать о соблюдении линейности выбранной методики для определения индометацина, кетопрофена, напроксена в крови, так как коэффициент их корреляции равен 0,9993—0,9998. При определении с использованием выбранной методики ибупрофена и диклофенака коэффициент их корреляции составляет 0,9877 и 0,9864 соответственно. Линейность не соблюдается в случае определения кеторолака, коэффициент корреляции которого 0,9658.

Правильность выбранной методики хромато-масс-спектрометрического определения после твердофазной экстракции НПВС в крови оценивали на всем диапазоне ее применения. Определение проводили с использованием модельных образцов крови с добавками НПВС в количестве 5, 20 и 30 мкг (для ибупрофена, напроксена) и в 2,5, 10 и 15 мкг (для диклофенака, индометацина, кетопрофена, кеторолака). Оценивали путем расчета разности между средним и принятым опорным значением с учетом доверительных интервалов среднего значения. Результаты по девяти определениям для каждого модельного образца крови (по три концентрации с трехкратным определением для каждой концентрации), представленные в табл. 3, подтвердили правильность валидируемых методик.

Результаты определения содержания НПВС по использованной методике правильные, так как найденные значения находятся внутри доверительного интервала соответствующего среднего результата проведенного анализа, полученного экспериментально. Результаты не отягощены существенной систематической погрешностью, так как соблюдается неравенство

Во всех случаях эта величина находится в диапазоне от 0,2 до 1,9985, что значительно ниже табличного значения критерия Стьюдента, равного 4,30 (при заданной доверительной вероятности Р=95% и числу степеней свободы f=n–1).

Для исследования повторяемости (сходимости) проанализировали девять модельных образцов крови в трех репликах для каждой концентрации шести НПВС. Пробоподготовку и анализ проводил в один день один аналитик и на одной и той же аппаратуре. Критерий приемлемости — коэффициент вариации должен быть не более 15% [7]. Результаты количественного определения диклофенака, ибупрофена, индометацина, кетопрофена, кеторолака и напроксена и полученные метрологические характеристики представлены в табл. 4.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о подтверждении прецизионности выбранной методики на уровне повторяемости, так как коэффициент вариации для всех исследований при анализе проб крови составил 0,36—5,51. При анализе в модельных образцах, содержащих кеторолак, выявлено, что коэффициент вариации больше 15%, что не подтверждает прецизионность выбранной методики на уровне повторяемости при анализе кеторолака в диапазоне выбранных концентраций.

Внутрилабораторную прецизионность исследовали путем анализа модельных образцов крови в разное время в одной лаборатории в течение 5 дней. Для этого приготовили по 3 раствора модельной смеси для каждой из трех концентраций. Каждый день исследовали по 9 образцов в трех концентрациях, каждую из которых повторяли по 3 раза. Результаты представлены в табл. 5.

Как видно из данных табл. 5, коэффициент вариации на всех уровнях концентрации не превышает 15%, что соответствует установленному критерию приемлемости для всех шести НПВС.

Предлагаемую методику хромато-масс-спектрометрического определения НПВС в крови с использованием ТФЭ можно применять для количественной оценки содержания индометацина, кетопрофена, напроксена при проведении химико-токсикологического и судебно-химического анализа.

Данную методику можно использовать для предварительного количественного определения ибупрофена и диклофенака при скрининге наркотических и лекарственных веществ в крови.

Для количественной оценки содержания кеторолака в крови методика непригодна, так как по результатам исследования выявлено ее несоответствие по характеристикам «линейность» и «повторяемость».

Конфликт интересов отсутствует.