Рассеянный склероз (РС) относится к группе воспалительных нейродегенеративных заболеваний центральной нервной системы с достаточно вариабельным и непредсказуемым течением. Наиболее часто (в 85—90% случаев) встречается ремиттирующая форма РС (РРС). Однако у 10—15% больных заболевание имеет первично-прогрессирующее течение (ППРС), которое характеризуется неуклонным нарастанием дефицита неврологических функций. Дебют ППРС происходит в среднем на 10 лет позже, чем при РРС, при этом отмечается равное соотношение полов больных и практически полное отсутствие случаев заболевания в детском возрасте [1]. При гистологическом исследовании в очагах демиелинизации при ППРС наблюдаются потеря олигодендроцитов [2, 3] и менее острое аксональное поражение, чем в очагах при РРС [4]. Однако процессы демиелинизации при ППРС обнаруживаются и в корковом сером веществе. При изучении гематоэнцефалического барьера у больных ППРС была выявлена его несостоятельность не только в активных очагах демиелинизации, но и в неактивных очагах, а также во внешне неизмененном белом и корковом сером веществе головного мозга [5]. Во внешне неизмененном белом веществе у больных ППРС отмечается сходная с больными вторично-прогрессирующей формой РС выраженность процессов демиелинизации и диффузных изменений с активацией микроглии и аксональным повреждением [6].

Одним из факторов, лежащих в основе фенотипических различий между ППРС и РРС, может быть генетическая гетерогенность этих форм Р.С. Действительно, несмотря на существование универсальных генетических маркеров, носительство которых судя по всему ассоциировано с РС независимо от его формы [7, 8], в ряде работ [9, 10] выявлены также однонуклеотидные полиморфизмы (single nucleotide polimorptisms — SNP), ассоциация аллелей и генотипов которых наблюдается только в случае ППРС и не характерна для РРС. К сожалению, вследствие значительных различий в распространенности двух форм РС большинство генетических исследований выполнено для больных РРС. В некоторых работах выборки были сформированы из больных РС с разными формами заболевания, а исследований, проведенных исключительно на больных ППРС, мало.

В некоторых исследованиях [7, 11, 12], включая один полногеномный анализ ассоциации (GWAS), была обнаружена достоверная ассоциация риска развития ППРС с носительством аллеля HLA-DRB1*1501. Исследования не-HLA-генов позволили выявить в некоторых популяциях участие в развитии ППРС полиморфных вариантов ряда генов, продукты которых вовлечены в процесс воспаления (CTLA4, IL4, IL4R, IL7RA, TNF, APOE и др.) [9, 10, 12, 13], а также генов, участвующих в нейродегенеративных процессах: CRYAB, CB1, GSK3b и др. [12, 14, 15]. Однако полученные результаты зачастую противоречивы, возможно, вследствие того, что исследования проводились на малых выборках больных и иногда без учета их этнической принадлежности.

Цель исследования — анализ вовлеченности генов иммунного ответа в патогенез ППРС путем изучения ассоциации с заболеванием полиморфных вариантов генов цитокинов и генов, участвующих в процессировании и презентации антигенов антигенпрезентирующими клетками (АПК).

Настоящее исследование было проведено на репрезентативной выборке больных ППРС русской этнической принадлежности, сформированной благодаря сотрудничеству ряда неврологических центров России. Для подтверждения у русских больных данных об ассоциации аллеля HLA-DRB1*15 с высоким риском развития ППРС, полученных для других этносов, использовали маркерный SNP rs3135388, аллель A которого сцеплен с аллелем HLA-DRB1*15 [16]. Среди генов цитокинов для анализа были выбраны гены, кодирующие интерлейкины (IL) — IL4 (rs2243250), IL6 (rs1800795) и IL17A (rs2275913), изменение уровня экспрессии которых обнаруживается у больных прогрессирующими формами РС [17]. В исследование также были включены ген PSMB9 (rs17587), который кодирует одну из субъединиц протеасомного комплекса, участвующего в процессировании антигенов, и ген CLEC16A (rs6498169), белковый продукт которого, член, А семейства 16 белков с С-лектиновым доменом (C-type lectin domain family 16 member A), участвует в формировании и транспорте HLA II-позитивных поздних эндосом в перинуклеарную область и необходим для презентации антигенов АПК [18], а также SNP в соседней межгенной области CLEC16A-SOCS1 (rs1640923). Для rs6498169 и rs1640923 в недавних исследованиях обнаружена значимая ассоциация с риском развития РС [19, 20], в то время как соседний ген SOCS1 регулирует сигналинг многих цитокинов, включая IL-2 и интерферон-гамма [21]. До сих пор роль выбранных нами не-HLA-генов в формировании генетической предрасположенности к ППРС не изучалась.

В исследование были включены 111 неродственных больных ППРС — 59 мужчин и 52 женщины. Пациентов обследовали на базе следующих учреждений — Московского межокружного отделения рассеянного склероза на базе Московской городской клинической больницы № 24, Новосибирского областного центра рассеянного склероза и других аутоиммунных заболеваний нервной системы, Тюменского областного центра рассеянного склероза (МСЧ «Нефтяник»), кабинета рассеянного склероза областной клинической больницы Свердловской области, кафедры нервных болезней с медицинской генетикой и нейрохирургией Ярославского государственного медицинского университета.

Диагноз РС ставился в соответствии с критериями МакДоналда (2010) [22]. Характеристики больных ППРС представлены в табл. 1.

Контрольную группу составили 234 здоровых — 90 мужчин и 144 женщины, средний возраст которых был 49,0±20,1 года.

Все включенные в исследование индивиды являлись этническими русскими по данным анкетирования и подписывали информированное согласие на участие в эксперименте. Исследование было одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова М.З. РФ.

ДНК выделяли из цельной венозной крови с использованием коммерческих наборов QIAamp DNA Blood MidiKit («Qiagen», Германия) или с помощью модифицированного метода экстракции смесью фенол-хлороформ [23]. Проведено генотипирование маркерного SNP аллеля HLA-DRB1*15 (rs3135388), а также SNP в генах IL4 (rs2243250), IL6 (rs1800795), IL17A (rs2275913), PSMB9 (rs17587), CLEC16A (rs6498169) и в межгенной области CLEC16A-SOCS1 (rs1640923). Их общая характеристика представлена в табл. 2.

Генотипирование CLEC16A-SOCS1 (rs1640923) проводили методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для генотипирования всех остальных SNP использовали ПЦР в реальном времени с конкурирующими TaqMan-зондами. Дизайн праймеров и TaqMan-зондов для SNP в генах IL4 (rs2243250), IL6 (rs1800795) и CLEC16A (rs6498169) осуществляли с помощью онлайн-инструментов Primer 3 и Primer-Blast [29, 30]. Последовательности праймеров и зондов для анализа SNP rs3135388 выбирались согласно [16]. Анализ SNP в генах IL17A (rs2275913) и PSMB9 (rs17587) проводили с использованием коммерческих наборов («Thermo Fisher Scientific», США).

Отклонение частот генотипов у больных ППРС и здоровых индивидов от равновесия Харди—Вайнберга оценивали с помощью критерия χ² в онлайн-приложении SNPStats [31]. Анализ ассоциации носительства аллелей и генотипов различных генов и их сочетаний с заболеванием проводили с применением программного обеспечения APSampler [32]. Силу ассоциаций выражали в значениях отношения шансов (ОШ). Значимыми считались ассоциации, у которых 95% доверительный интервал (ДИ) для ОШ не пересекал 1, а значение p по точному критерию Фишера было меньше 0,05 для отдельных генов и меньше 0,01 для их сочетаний. Анализ неравновесного сцепления полиморфных вариантов, расположенных в непосредственной близости друг к другу, осуществляли с помощью алгоритма HaploView [33]. Для определения силы сцепления использовали показатели логарифма ОШ (LOD) и нормализованного коэффициента неравновесного сцепления Левонтина (D’). При D’<1 и LOD<2 сцепление полиморфных вариантов считали слабым, при D’<1 и LOD>2 — значительным, а при D’=1 и LOD>2 — сильным.

Определены частоты носительства аллелей и генотипов всех выбранных для анализа SNP в группах больных ППРС и здоровых индивидов. Распределение генотипов всех полиморфных локусов в контрольной группе соответствовало равновесию Харди—Вайнберга для всех SNP. В группе больных ППРС отклонение от равновесия было зафиксировано для полиморфизма rs17587 в гене PSMB9 (p=0,014), что может объясняться вовлечением этого SNP в патогенез заболевания.

Проведенный анализ ассоциации носительства аллеля HLA-DRB1*15 и генотипа HLA-DRB1*15/15, а также аллелей и генотипов SNP в генах IL4, IL6, IL17A, PSMB9, CLEC16A и в межгенной области CLEC16A-SOCS1 с ППРС у русских больных позволил выявить полиморфные варианты, ассоциированные с высоким риском развития этой формы РС поодиночке (табл. 3). Носительство аллеля HLA-DRB1*15 и генотипа HLA-DRB1*15/15 оказалось значимо ассоциированным с высоким риском развития ППРС (p=0,000055 и p=0,0024, ОШ [95% ДИ]=2,61 [1,63—4,20] и 8,94 [1,87—42,85] соответственно). Среди не-HLA-генов ассоциация с предрасположенностью к ППРС была показана для SNP в генах IL4 и CLEC16A. Генотипы IL4*С/C и CLEC16A*G/G значимо чаще встречались в группе больных ППРС, чем у здоровых индивидов контрольной группы (p=0,0029 и p=0,0061, ОШ [95% ДИ]=2,09 [1,25—3,49] и 2,20 [1,23—3,93] соответственно). Для остальных полиморфных вариантов значимых одиночных ассоциаций с развитием ППРС не выявлено.

Для выявления сочетаний аллелей/генотипов исследуемых полиморфных локусов, ассоциированных с предрасположенностью к ППРС, проведен мультилокусный анализ с использованием программного обеспечения APSampler [32]. Результаты анализа представлены в табл. 4. Выявлена значимая ассоциация с ППРС трех биаллельных сочетаний (CLEC16A*G/G+PSMB9*G), (IL4*C/C+PSMB9*G) и (IL4*C+PSMB9*G), которые, помимо SNP в генах CLEC16A и IL4, связанных с ППРС поодиночке, содержат также аллель G полиморфного варианта гена PSMB9 (p=0,0012, p=0,0016 и p=0,0018, ОШ [95% ДИ]=2,68 [1,46—4,92], 2,18 [1,31—3,63] и 4,36 [1,50—12,70] соответственно), существенно повышающий уровень значимости наблюдаемых ассоциаций.

Нами был проведен анализ возможного неравновесного сцепления полиморфных вариантов в гене CLEC16A и соседней межгенной области CLEC16A-SOCS1, находящихся в одном регионе 16-й хромосомы 16p13.13, а также SNP генов PSMB9 и IL17A, расположенных в регионах 6-й хромосомы 6p12 и 6p21.3 соответственно. Значительное сцепление (D’=0,60, LOD=3,75) обнаруживается только для полиморфизмов в области 16p13.13, в то время как SNP в генах PSMB9 и IL17A скорее всего не сцеплены друг с другом (D’=0,11, LOD=0,44) (см. рисунок).

В настоящем исследовании впервые показано, что носительство каждого из генотипов IL4 (rs2243250)*C/C и CLEC16A (rs6498169)*G/G позитивно ассоциировано с развитием ППРС у русских больных, а также валидирована описанная в исследованиях на других популяциях ассоциация HLA-DRB1*15 с высоким риском развития этой формы РС.

Роль носительства аллеля С SNP IL4 (rs2243250) как фактора риска ППРС подтверждается также тем, что генотип IL4 (rs2243250)*C/C и аллель IL4 (rs2243250)*C входят в состав биаллельных сочетаний, которые предрасполагают к развитию ППРС с бóльшим уровнем значимости (р=0,0016 и p=0,0018) и более высокими значениями ОШ (до 4,36), чем генотип IL4 (rs2243250)*C/C в отдельности (см. табл. 3 и 4). В то же время мы не наблюдали ассоциации полиморфного варианта rs2243250 гена IL4 с предрасположенностью к РРС ни при семейном анализе [34], ни с применением подхода «ген-кандидат» на расширенной выборке русских больных РРС (данные не опубликованы). Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что этот полиморфизм гена IL4 у русских больных связан с риском развития ППРС, но не РРС.

К настоящему времени проведено всего несколько исследований ассоциации различных полиморфных вариантов гена IL4 с развитием ППРС. Выбранный нами SNP IL4 (rs2243250) изучался только в одной из работ для выборки пациентов из США и оказался не связан с ППРС, тогда как аллель T другого полиморфного варианта гена IL4 rs2070874, локализованного в первом экзоне, встречался у больных ППРС существенно чаще, чем у больных РРС [35]. Однако группа больных ППРС в работе [35] включала всего 12 человек, поэтому полученные результаты носят самый предварительный характер, о чем упоминают и сами авторы. На выборке больных ППРС из Северной Ирландии (95 человек) была показана обратная ассоциация аллелей IL4 (rs2070874): аллель rs2070874*С чаще встречался у больных ППРС, чем у больных РРС, как поодиночке, так и в составе сочетания с аллелем B2 интронного полиморфизма числа тандемных повторов (VNTR) [36]. При всей своей противоречивости результаты, описанные в работах [35, 36], укладываются в представление о том, что варианты гена IL4 в разной степени вовлечены в развитие ППРС и РРС, и тем самым согласуются с выводами, сделанными в настоящем исследовании.

IL4, один из важнейших противовоспалительных цитокинов, продуцируемый в основном Th2-лимфоцитами, участвует в ингибировании клеточного иммунного ответа во многом за счет подавления активности Th1-клеток [37]. IL4 также вовлечен в процессы репарации поврежденных тканей [38]. Ключевая роль IL4 в регуляции воспалительных процессов объясняет вовлечение этого цитокина в патогенез как экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, так и РС [15, 17, 36, 39]. Поскольку в экспериментах in vitro показано, что носительство генотипа С/C гена IL4 ведет к снижению уровня продукции IL4 в клеточной линии Т-лимфоцитов человека [24], полученная ассоциация может быть следствием пониженного уровня экспрессии гена IL4 у носителей этого генотипа, что, вероятно, способствует активации аутоиммунных воспалительных реакций при ППРС.

Впервые обнаружена ассоциация генотипа CLEC16A (rs6498169)*G/G, как в отдельности, так и в составе биаллельного сочетания, с ППРС, что свидетельствует о том, что этот генотип является фактором риска ППРС. Ранее мы показали, что этот генотип ассоциирован с развитием у русских больных РРС [40], в полном соответствии с данными, полученными ранее другими исследователями для больных РРС европеоидного происхождения [19, 41, 42]. Таким образом, мы приходим к заключению, что полиморфизм гена CLEC16A (rs6498169) вовлечен в формирование предрасположенности к РС независимо от его формы.

Ассоциация SNP rs6498169 с РС может быть обусловлена функциональным значением гена CLEC16A, белковый продукт которого продуцируется в основном в клетках иммунной системы, включая дендритные клетки, B-лимфоциты, NK-клетки [43], и выступает как важнейший регулятор презентации антигенов в контексте молекул HLA класса II в АПК [18]. В исследованиях на мышах было также показано вовлечение Clec16a в процессы аутофагии и Т-клеточной селекции в тимусе [44]. Тот факт, что мы не выявили значимой ассоциации SNP rs1640923, расположенного в межгенной области CLEC16A-SOCS1, с риском развития ППРС при наличии его значительного сцепления с rs6498169 гена CLEC16A, может служить подтверждением вовлеченности именно последнего в формирование предрасположенности к ППРС. Однако эти результаты могут объясняться и недостаточной статистической мощностью анализа, связанной с низкой частотой минорного аллеля CLEC16A-SOCS1(rs1640923) (13,5% в контрольной группе). Таким образом, роль этого полиморфного варианта в патогенезе ППРС еще предстоит прояснить.

На выборке русских больных нами была валидирована ассоциация аллеля HLA-DRB1*15 и генотипа HLA-DRB1*15/15 с предрасположенностью к ППРС, показанная ранее в ряде работ с участием различных этносов, в том числе в одном GWAS [7, 11, 12]. В то же время участие этого аллеля в формировании предрасположенности к РРС не подлежит сомнению, так как подтверждено в различных популяциях на обширных выборках больных [45]. Эти данные в совокупности приводят к заключению, что аллель HLA-DRB1*15 является сильным маркером предрасположенности к РС независимо от его формы.

С помощью мультилокусного анализа впервые удалось выявить ассоциацию с ППРС SNP PSMB9 rs17587 (в составе сочетаний). Ранее уже была показана ассоциация генотипа PSMB9*G/G с предрасположенностью к ревматоидному артриту [46] и болезни Паркинсона [47], что может свидетельствовать о вовлечении SNP rs17587 в гене PSMB9 в развитие аутоиммунных воспалительных процессов. У носителей аллеля PSMB9*G происходит замена гистидинового остатка на аргининовый в аминокислотной последовательности субъединицы 9 иммунопротеасомного комплекса, что может приводить к изменению эффективности процессинга антигенов, и, например, при заражении вирусом гепатита С вызывает хронизацию воспалительного процесса [27].

В целом результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что гены иммунного ответа вовлечены в развитие ППРС, указывая на важность иммунной составляющей в патогенезе этой формы Р.С. При этом обнаруживаются как универсальные генетические маркеры, носительство которых ассоциировано с РС независимо от его формы, так и SNP, носительство аллелей и генотипов которых способствует преимущественному развитию одной из двух основных форм заболевания. К универсальным маркерам относятся HLA-DRB1*15, несомненное участие которого в развитии РС показано для всех популяций, и CLEC16A (rs6498169)*G/G, который, по нашим данным, служит фактором риска ППРС и РРС, тогда как полиморфизм гена IL4, по крайней мере у русских больных, связан с риском развития ППРС, но не РРС.

Работа поддержана грантом РФФИ 15−04−04866.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.