Сравнительный анализ частот аллельных вариантов rs1801133 и rs1801131 гена MTHFR в выборке пациентов, перенесших ишемический инсульт, и у здорового населения в Московском регионе

Авторы:
  • О. П. Дрибноходова
    ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва, Россия
  • В. И. Корчагин
    ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва, Россия
  • К. О. Миронов
    ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва, Россия
  • Е. А. Дунаева
    ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва, Россия
  • А. В. Титков
    ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва, Россия
  • Э. В. Аксельрод
    ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва, Россия
  • А. А. Раскуражев
    ФГБНУ «Научный центр неврологии», Москва, Россия
  • М. М. Танашян
    ФГБНУ «Научный центр неврологии», Москва, Россия
  • С. Н. Иллариошкин
    ФГБНУ «Научный центр неврологии», Москва, Россия
  • А. Е. Платонов
    ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва, Россия
  • Г. А. Шипулин
    ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва, Россия
Журнал: Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. Спецвыпуски. 2019;119(3): 18-23
Просмотрено: 1263 Скачано: 107

Ген MTHFR кодирует метилентетрагидрофолатредуктазу — один из ключевых ферментов фолатного цикла. Однонуклеотидные замены (SNP) rs1801133 (A222V, 677C>T) и rs1801131 (E429A, 1298A>C) в этом гене приводят к образованию термолабильной формы фермента, снижению его активности и, как следствие, к повышению уровня гомоцистеина в крови и снижению синтеза метионина. Накопление гомоцистеина обусловливает повреждение эндотелия сосудов и оказывает нейротоксический эффект, а дефицит метионина может приводить к нарушению синтеза и метилирования ДНК [1, 2]. Гипергомоцистеинемия является важным фактором риска развития таких заболеваний, как ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, атеросклероз, венозный тромбоз, инсульт и сахарный диабет, а также ассоциирована с риском нейродегенеративных заболеваний и фетоплацентарной недостаточности [1—4]. Для аллеля Т полиморфизма rs1801133 показана ассоциация с возникновением дефектов нервной трубки у плода и другими патологиями беременности, развитием тромбофилии, ишемического инсульта (ИИ), шизофрении, осложнений сахарного диабета. rs1801131 рассматривается как возможный фактор риска развития тромбозов, ИИ и акушерской патологии [2—4].

В свою очередь большинство патологий, ассоциированных с геном MTHFR, являются многофакторными — генетическая предрасположенность к ним определяется совместным влиянием многих полиморфных локусов, как, например, в случае с И.И. Информация о частотах аллелей в популяции может быть использована в алгоритмах расчета генетических рисков с целью выявления лиц, относящихся к группе с высоким риском развития патологии для проведения своевременных профилактических мероприятий [3, 5, 6]. Известно, что частоты аллелей и генотипов rs1801133 и rs1801131 в разных популяциях отличаются [1], однако информации о частотах их генотипов и гаплотипов в отечественной популяции недостаточно.

Цель исследования — определение частот аллелей и генотипов rs1801133 и rs1801131 в выборках лиц без признаков острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) на момент обследования и выборках больных атеротромботическим (АТ) и кардиоэмболическим (КЭ) подтипами ИИ у жителей Московского региона, а также сопоставление полученных частот с частотами в других европейских популяциях.

Материал и методы

В работе использовано 645 образцов геномной ДНК человека, выделенной из клеток периферической крови с помощью набора реагентов РИБО-преп (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии»). Группу популяционного контроля составили жители Московского региона (n=360) трех возрастных групп (до 45 лет, 46—60 и 61—75 лет, 178 мужчин и 182 женщины) без признаков ОНМК на момент взятия клинического материала, и не являющихся родственниками [7]. Группу больных с ИИ составили 111 пациентов с АТ и 81 с КЭ подтипами ИИ, госпитализированных в Научный центр неврологии с диагнозом ИИ в 2013—2016 гг. [6]. Материалом для исследования служила ДНК, выделенная из крови пациентов, взятой для стандартных лабораторных анализов. Пациенты давали согласие на использование полученного материала в научных и исследовательских целях без использования персональных данных (в обезличенном виде). Также в работе использовали результаты генотипирования пациентов с АТ (59) и КЭ (34) подтипами ИИ, проведенного ранее в рамках клинических испытаний набора реагентов для определения риска развития ИИ​1​᠎.

Средний возраст первого инсульта у больных составлял 63 года для АТ и 64 для КЭ, выборка содержит 114 женщин (65 АТ и 49 КЭ) и 171 мужчину (105 АТ и 66 КЭ).

Генотипирование проводили методом мультиплексной ПЦР в реальном времени с конформационно-блокированными (LNA) зондами, аналогично методике, использованной в [7]. При создании и апробации методики, а также для верификации результатов проводилось определение нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, содержащих SNP, с помощью пиросеквенирования [8].

Информация о частотах аллелей rs1801133 и rs1801131 в европейских популяциях (Caucasian) была получена из соответствующих баз даных международных проектов 1000 Genomes Project (выборка EUR, n=503) [9] и International HapMap Project (выборка HapMap-CEU, n=113) [10].

Статистический анализ распределения частот аллелей и генотипов в выборках и оценку их ассоциации с риском развития ИИ проводили в среде R с использованием стандартных функций для расчета критерия χ2 Пирсона и точного теста Фишера [11]. Оценку LD между локусами проводили с использованием коэффициента корреляции r2 Пирсона посредством среды R и пакета genetics (genetics: Population Genetics. R package ver. 1.3.8.1) [12]. Для анализа отклонения частот генотипов от равновесия Харди—Вайнберга использовали пакет HardyWeinberg (HardyWeinberg: Statistical Tests and Graphics for Hardy—Weinberg Equilibrium. R package ver. 1.6.0) [13, 14]. Статистически значимыми считались различия при значении p<0,05.

Результаты

В результате проведенного анализа частот аллелей и генотипов обоих SNP в возрастных группах здорового контроля не было выявлено статистически значимых различий (p>0,05). Также было установлено, что в контрольной группе между выборками разного пола статистически значимых различий по частотам аллелей, анализируемых SNP, нет (p>0,05), поэтому в дальнейшем мы не разделяли контроль по возрасту и полу.

Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов изучаемых локусов в выборках пуляционного контроля и у больных с АТ и КЭ подтипами ИИ представлен в табл 1.

Таблица 1. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов локусов rs1801133 и rs1801131 в выборках больных и здоровых индивидов Московского региона Примечание. χ2 (p) — Хи-квадрат Пирсона и уровень значимости p при сравнении групп больных с контрольной группой, ОШ — отношение шансов, ДИ — доверительный интервал, pHW — уровень статистической значимости отклонения от равновесия Харди—Вайнберга.
В анализируемых выборках не было обнаружено отклонения от равновесия Харди—Вайнберга (см. табл. 1) сцепления обоих SNP (табл. 2)
Таблица 2. Распределение комбинаций генотипов в анализируемых выборках Примечание. p — уровень статистической значимости точного критерия Фишера межгрупповых различий выборок больных и здорового контроля по частотам комбинаций генотипов.
(r2=0,18). При анализе ассоциации аллелей и генотипов rs1801133 и rs1801131 с риском развития ИИ не было выявлено статистически значимых различий между выборками (p>0,05). Эти результаты совпадают с данными, полученными в исследованиях 1000 Genomes Project для европейских популяций и HapMap-CEU (r2=0,26 и r2=0,22 соответственно).

При проведении сравнительного анализа выявлено статистически значимое различие между выборкой населения Московского региона и выборкой 1000 Genomes Project (p<1·10–4) по частотам аллелей rs1801133. Отдельный анализ частот аллелей в субпопуляциях EUR 1000 Genomes Project [9] по состоянию на 01.08.18 показал, что статистически значимыми являются различия между выборкой населения Московского региона и выборками IBS (Испания) и TSI (Италия) (p<1·10–5), в то время как для остальных выборок различия незначимы (p>0,05) (табл 3).

Таблица 3. Различия в частотах аллелей rs1801133 и rs1801131 между выборкой населения Московского региона, русского населения Томска [15], населения Санкт-Петербург [16] и европейскими субпопуляциями выборки EUR 1000 Genomes Project [9] Примечание. χ2 — Хи-квадрат Пирсона; p — уровень значимости. Жирным шрифтом выделены статистически значимые результаты.

Отличия от выборки HapMap для обоих полиморфизмов и от выборки 1000 Genomes Project по частотам аллелей rs1801131 были статистически незначимы (p>0,05). Также было проведено сравнение полученных частот аллелей и генотипов обоих полиморфизмов с частотами для русского населения Томска [15] и коренного населения Санкт-Петербурга [16]. По распределению сочетаний генотипов rs1801133/rs1801131 выборка населения Московского региона соответствует северо- и центральноевропейским субпопуляциям и так же, как они, отличается от южноевропейских выборок IBS и TSI (см. рисунок).

Распределение комбинаций генотипов в европейских выборках. RU — русские, Московский регион (собственные данные); FIN — финны, Финляндия; CEU — белые северо- и западноевропейского происхождения, Юта, США; GBR — британцы, Англия и Шотландия; IBS — иберийцы, Испания; TSI — тосканцы, Италия (1000 Genomes Project).

Обсуждение

Определены частоты аллелей и генотипов двух клинически значимых SNP в выборке населения Московского региона. Выявленные частоты близки к описанным ранее для русского населения других территорий [15, 16], что позволяет использовать полученные данные для расчета генетического риска заболеваний как популяционные значения для русского населения независимо от географической принадлежности исследуемой выборки.

Обнаруженные отличия в частотах аллелей анализируемых полиморфизмов от частот в других европеоидных популяциях свидетельствуют о генетических особенностях исследуемой популяции, которые необходимо учитывать при расчете среднепопуляционных и индивидуальных рисков развития заболеваний, ассоциированных с этими SNP, и оценке возможного совместного вклада комбинаций аллелей. Значимые отличия в частотах аллелей rs1801133 от популяций Южной Европы (выборки TSI и IBS 1000 Genomes Project), чем от северных популяций (выборки GBR, FIN и CEU 1000 Genomes Project) согласуется с описанным ранее географическим градиентом частот аллелей этого локуса в Европе и Северной Америке с наибольшей частотой аллеля Т в Испании и Италии [1, 15] (см. рисунок).

Выявленное в данной работе отсутствие в исследуемых выборках сочетаний генотипов CT/CC, TT/AC и TT/CC (rs1801133/rs1801131) (см. табл. 2) соответствует показанной в отечественных и зарубежных исследованиях крайне низкой частоте сочетания аллелей rs1801133 T/rs1801131 C (0—0,5% в большинстве изученных популяций) [16—18].

В результате проведенного анализа частот исследуемых SNP в выборке популяционного контроля и у больных с АТ и КЭ подтипами ИИ не выявилено ассоциаций между генотипами по обоим полиморфизмам и их сочетаниями с риском развития различных подтипов ИИ, что может быть связано как с недостаточным объемом проанализированных выборок, так и с отсутствием влияния этих SNP на риск возникновения И.И. Ранее для полиморфизма rs1801133 в ряде популяций была показана ассоциация аллеля Т с ИИ [1, 5]. Для более достоверной оценки влияния полиморфизмов rs1801133 и rs1801131, а также комбинаций их аллелей на риск развития ИИ требуются дополнительные исследования, учитывающие другие независимые факторы риска развития ИИ (пол, возраст, сопутствующие заболевания, наличие аллелей риска в других генах) [6].

Полученные данные о частотах аллелей и генотипов могут быть использованы для анализа генетических рисков других заболеваний и состояний, связанных с генетически обусловленным нарушением фолатного обмена [2].

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Дрибноходова О.П. — https://orcid.org/0000-0003-4918-4907

Корчагин В.И. — e-mail: vitaly-korchagin@rambler.ru; https://orcid.org/0000-0003-2264-6294

Миронов К.О. — https://orcid.org/0000-0001-8207-9215

Дунаева Е.А. — https://orcid.org/0000-0002-4477-8506

Титков А.В. — e-mail: anton.titkov@bk.ru; https://orcid.org/0000-0001-7548-9267

Аксельрод Э.В. — https://orcid.org/0000-0001-6008-4339

Раскуражев А.А. — https://orcid.org/0000-0003-0522-767X

Танашян М.М. — https://orcid.org/0000-0002-5883-8119

Иллариошкин С.Н. — https://orcid.org/0000-0002-2704-6282

Платонов А.Е. — https://orcid.org/0000-0001-7450-0081

Шипулин Г.А. — https://orcid.org/0000-0002-3668-6601

Автор, ответственный за переписку: Корчагин Виталий Иванович — e-mail: vitaly_korchagin@rambler.ru

1Миронов К.О., Дрибноходова О.П., Дунаева Е.А., Корчагин В.И., Платонов А.Е., Шипулин Г.А. Способ определения индивидуального генетического риска развития ишемического инсульта. Патент Р.Ф. на изобретение от 09.03.17 № 2612630 Бюл. № 7.

Список литературы:

  1. Liew S, Gupta E. Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T polymorphism: Epidemiology, metabolism and the associated diseases. European Journal of Medical Genetics. 2015;58(1):1-10. https://doi.org/10.1016/j.ejmg.2014.10.004
  2. Генетический паспорт — основа индивидуальной и предиктивной медицины. Под ред. Баранова В.С. СПб.: Издательство Н-Л; 2009.
  3. Корчагин В.И., Миронов К.О., Дрибноходова О.П., Максимова М.Ю., Иллариошкин С.Н., Танашян М.М., Платонов А.Е., Шипулин Г.А., Раскуражев А.А., Пирадов М.А. Роль генетических факторов в формировании индивидуальной предрасположенности к ишемическому инсульту. Анналы клинической и экспериментальной неврологии. 2016;10(1):65-75.
  4. Бурденный А.М., Логинов В.И., Заварыкина Т.М., Брага Э.А., Кубатиев А.А. Молекулярно-генетические нарушения генов фолатного и гомоцистеинового обмена в патогенезе ряда многофакторных заболеваний. Генетика. 2017;53(5):526-540. https://doi.org/10.7868/S001667581704004X
  5. Титов Б.В., Матвеева Н.А., Мартынов М.Ю., Фаворова О.О. Ишемический инсульт как комплексное полигенное заболевание. Молекулярная биология. 2015;49(2):224-248. https://doi.org/10.7868/S0026898415020135
  6. Корчагин В.И., Миронов К.О., Платонов А.Е., Дрибноходова О.П., Аксельрод Э.В., Дунаева Е.А., Раскуражев А.А., Танашян М.М., Максимова М.Ю., Иллариошкин С.Н., Шипулин Г.А. Комплексная оценка вклада генетических факторов в развитие ишемического инсульта. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2017;117(12):11-18. https://doi.org/10.17116/jnevro201711712211-18
  7. Дрибноходова О.П., Миронов К.О., Корчагин В.И., Дунаева Е.А., Аксельрод Э.В., Титков А.В., Платонов А.Е., Шипулин Г.А. Характеристика 48 полиморфных локусов — потенциальных маркеров риска развития ишемического инсульта. Генетика. 2017;53(6):716-721. https://doi.org/10.7868/S0016675817060042
  8. Миронов К.О., Дунаева Е.А., Дрибноходова О.П., Шипулин Г.А. Опыт использования систем генетического анализа на основе технологии пиросеквенирования. Справочник заведующего КДЛ. 2016;(5):33-43.
  9. Genomes Project Consortium. A global reference for human genetic variation. Nature. 2015;526(7571):68-74. https://doi.org/10.1038/nature15393
  10. International HapMap Consortium. A second generation human haplotype map of over 3.1 million SNPs. Nature. 2007;449:851-861. https://doi.org/10.1038/nature06258
  11. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. 2017. R Foundation for Statistical Computing. Vienna. Austria. https://www.R-project.org/
  12. Warnes G, with contributions from Gregor Gorjanc, Leisch F, Man M. genetics: Population Genetics; 2013. R package version 1.3.8.1 http://CRAN.R-project.org/package=genetics
  13. Graffelman J and Morales-Camarena J. Graphical tests for Hardy-Weinberg Equilibrium based on the ternary plot. Human Heredity. 2008;65(2):77-84. https://doi.org/10.1159/000108939
  14. Graffelman J. Exploring Diallelic Genetic Markers: The HardyWeinberg Package. Journal of Statistical Software. 2015;64(3):1-23. https://doi.org/10.18637/jss.v064.i03
  15. Trifonova EA, Eremina ER, Urnov FD, Stepanov VA. The genetic diversity and structure of linkage disequilibrium of the MTHFR gene in populations of Northern Eurasia. Acta Naturae. 2012;4(1):53-69.
  16. Колосков А.В., Филиппова О.И., Лыщев А.А., Батурина О.А., Васильева М.Ю., Гуляихина Д.Е., Никитин М.М., Богданов К.В. Частота встречаемости полиморфизмов гена фактора V (A506G), гена протромбина (G20210A) и гена MTHFR (C677Т и A1298С) у здоровых доноров крови Санкт-Петербурга. MEDLINE.RU. Российский биомедицинский журнал. 2015;16(3):682-689. http://medline.ru/public/art/tom16/art62.html
  17. Hubacek JA, Rynekrova J, Kasparova D, Fait T, Adamkova V, Holmes MV. Association of MTHFR genetic variants C677T and A1298C on predisposition to spontaneous abortion in Slavonic population. Clinica Chimica Acta. 2015;440:104-107. https://doi.org/10.1016/j.cca.2014.11.018
  18. Ogino S, Wilson RB. Genotype and haplotype distributions of MTHFR 677C/T and 1298A/C single nucleotide polymorphisms: a meta-analysis. Journal of Human Genetics. 2003;48(1):1-7. https://doi.org/10.1007/s100380300000