Согласно данным зарубежной литературы, нейроиммунные взаимодействия в условиях инсульта носят характер «перекрестных помех»: индуцированная инсультом иммунодепрессия, угрожая развитием инфекционно-воспалительных заболеваний, с одной стороны, ограничивает аутоагрессию к нейронам вблизи очага инсульта — с другой [1]. Результаты морфологических исследований свидетельствуют об активном обеднении лимфоцитами тимуса при инсульте [2]. Доказана и роль лимфоцитов, мигрирующих в кровяное русло из селезенки, в формировании воспалительной пенумбры, стратегию спасения которой связывают именно с иммунотерапией [3]. Таким образом, комбинированное изучение неврологического и иммуноморфологического аспектов геморрагического инсульта, может стать фундаментом для формирования алгоритмов иммунотерапии заболевания.
Цель исследования — изучить особенности и динамику изменения неврологического статуса и морфологии лимфоидной ткани трахеи у крыс с различной стрессоустойчивостью при инсульте.
Материал и методы
Исследовали трахеи 98 крыс-самцов линии Вистар массой тела 250—300 г в возрасте 4—6 мес. Для оценки стрессоустойчивости животных разделили на группы и за 3 сут до моделирования геморрагического инсульта (ГИ) определяли их поведенческую активность в открытом поле. Открытое поле — освещенная (100 Вт) круглая арена (d=90 см, h=40 см), разделенная радиальными и круговыми линиями на 37 секторов. С помощью теста регистрировали латентные периоды первого перемещения и выхода крысы в центр поля, количество пересеченных животным периферических и центральных секторов поля, количество периферических и центральных стоек, исследовательскую активность (заглядывание в норы). Рассчитывали индекс активности (ИА) крыс:
ИА=сумма пересеченных периферических и центральных секторов/сумма латентных периодов первого движения и выхода в центр.
Активность животных при тестировании в открытом поле коррелирует с их устойчивостью к различным стрессовым воздействиям [4]. Для эксперимента отбирали высокоактивных устойчивых к стрессу крыс (УСК) с ИА от 2,25 до 5,8, а также низкоактивных крыс — неустойчивых к стрессу (НСК) — ИА от 0,25 до 0,79, амбивалентные животные исключались. Из 160 протестированных животных для последующего исследования было отобрано 49 УСК и 49 НСК. Группы УСК и НСК были разделены на подгруппы: норма, контроль, эксперимент. У крыс экспериментальных подгрупп ГИ воспроизводили по модифицированному методу W. Deinsberger [5]. Этот метод предполагает двукратное введение аутокрови в указанную структуру головного мозга животных. Животных наркотизировали внутрибрюшинной инъекцией раствора хлоралгидрата (400 мг/кг массы тела). Иглу №22 с закругленным концом погружали в головной мозг крыс через отверстие в черепе диаметром 0,5 мм по стереотаксическим координатам A 0,7 мм, L 3 мм, H 6 мм (левое хвостатое ядро мозга). Кровь получали из бедренной вены непосредственно перед ее введением в область хвостатого ядра, гепарин не добавляли. Объем вводимой аутокрови составлял 60 мкл: 20 мкл крови в течение 7 мин, через 10 мин — 40 мкл крови в течение 10 мин. Через 5 мин после введения аутокрови канюлю медленно извлекали, отверстие в черепе закрывали стоматологическим цементом. Моделируемый таким способом ГИ по локализации соответствует внутримозговым кровоизлияниям, возникающим у людей при разрыве лентикулостриарных артерий. Крысам контрольных подгрупп проводили ложную операцию (те же манипуляции, исключая введение аутокрови в мозг). Исследование проводили в соответствии с принципами Базельской декларации и рекомендациями этической комиссии НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН (протокол №1, 3 сентября 2005 г.) а также требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных. Неврологический статус крыс оценивали в контрольных и экспериментальных группах по шкале Menzies к концу 1, 3 и 7-х суток после операций [6]. Шкала включала отсутствие неврологических симптомов (0 баллов); тоническую флексию передней противоположной стороне инсульта лапы при подъеме за хвост (1 балл); меньше сопротивление пассивному движению, оказываемое противоположной передней лапой при потягивании за хвост (2 балла); движение в противоположную очагу сторону при удержании крысы за хвост (3 балла); спонтанное вращение крысы на горизонтальной поверхности в противоположную сторону (4 балла). Выведение из эксперимента проводилось сразу после тестирования методом декапитации (1, 3 и 7-е сутки эксперимента. Животных вскрывали, трахею препарировали целиком, выделяли зону вблизи бифуркации. Материал забирали в течение 3 мин после умерщвления и фиксировали в 10% формалине с последующей стандартной спиртовой проводкой и заливкой в парафин. Из парафиновых блоков готовились срезы толщиной 5 мкм, которые окрашивались гематоксилин-эозином и азур-2-эозином для проведения морфологического исследования методом светооптической микроскопии (микроскоп МБИ-3). В лимфоидных узелках стенки трахеи проводили подсчет клеток лимфоидного ряда с помощью 25-узловой морфометрической сетки на стандартной площади гистологического среза, равной 880 мкм2, в 10 полях зрения. Статистическую обработку результатов проводили по общепринятой методике [7]. Полученный цифровой материал обработан на ПЭВМ (ОС Windows XP) с применением статистического пакета программ SPSS17 методами непараметрической статистики. Для числовых показателей рассчитывали средние арифметические значения абсолютных и относительных величин (M) и их стандартные ошибки (m). Различия оценивали как значимые при p≤0,05 (по U-критерию Манна—Уитни).
Результаты и их обсуждение
На 1-е сутки после моделирования инсульта фокальная неврологическая симптоматика выявлялась как у УСК, так и у НСК. Парез передней лапы, противоположной очагу поражения, у УСК по шкале Menzies оценивали в 1,4 балла, а у НСК — в 1,9 балла (см. рисунок). На 3-и сутки эксперимента наблюдали уменьшение неврологического дефицита у крыс обеих групп по сравнению с 1-ми сутками: симптоматику оценивали в 1,2 и 1,6 балла у УСК и НСК соответственно. К 7-м суткам степень выраженности неврологического дефицита у УСК продолжала уменьшаться (до 0,8 балла). У НСК выявлялся регресс: неврологическая симптоматика нарастала (до 1,7 балла по шкале Menzies). Динамика морфологических изменений ткани мозга и неврологической симптоматики на всех сроках инсульта неодинакова у УСК и НСК. Выраженность неврологического дефицита и морфологических нарушений мозга выше у НСК.
Неврологический статус крыс в условиях моделирования геморрагического инсульта (шкала Menzies, баллы).
По шкале ординат — баллы, по шкале абсцисс — сроки эксперимента (1, 3 и 7-и сутки).
Neurological status of rats under modeling hemorrhagic stroke (in points on the Menzies scale).
On the vertical scale — points, on the horizontal scale — the timing of the experiment (1, 3 and 7 days).
Согласно нашим данным и результатам ранних исследований [8], важную роль в развитии неврологической симптоматики при инсульте могут играть морфологические изменения гипоксического характера в сенсомоторной коре мозга крыс.
Клеточный состав лимфоидной ткани стенки трахеи крыс в условиях моделирования геморрагического инсульта заметно изменяется, причем неодинаково у крыс с различной устойчивостью к эмоциональному стрессу.
На 1-е сутки эксперимента у УСК общее количество клеток в лимфоидных узелках увеличивается (в центре узелка в 1,32 раза, до 45,6±1,22 клеток; p=0,009), за счет малых и средних лимфоцитов. У НСК общее количество, напротив, уменьшается (в центре в 1,21 раза, до 27,3±0,74 клеток; p=0,046) за счет сокращения количества малых лимфоцитов: в центральной части в 1,25 раза — до 15,0±1,2 клеток. В узелках появляются бласты, увеличивается количество больших лимфоцитов (у УСК в центре узелков в 1,4 раза, до 2,6±0,46 клеток; p=0,045); у НСК в основании узелков в 3,8 раза, до 1,9±0,45 клеток; p=0,018). Уменьшается содержание плазматических клеток (у УСК в верхушке узелков в 2,66 раза, до 0,6±0,36; p=0,01; у НСК в центре узелков в 9 раз, до 0,1±0,09 клеток; p=0,049). Растет содержание в узелках деструктивно измененных клеток: в центре узелков у УСК их количество увеличивается в 1,8 раза (до 5,6±0,54 клеток; p=0,024), а у НСК — в 2,79 раза (до 9,5±1,19, p=0,001). Таким образом, уже на 1-е сутки НСК реагируют обеднением лимфоидных узелков лимфоцитами как ввиду более активной миграции их в просвет органа [9], так и по причине более интенсивной деструкции клеток, чем у УСК.
На 3-и сутки инсульта в лимфоидных узелках трахеи у крыс с различной устойчивостью к стрессу происходят сходные изменения: у УСК общее количество клеток в узелках уменьшается (в центре в 1,46 раза, до 31,1±2,31 клеток; p=0,003), а у НСК продолжает уменьшаться (в центре в 1,15 раз, до 32,4±1,34 клеток; p=0,039) за счет средних и малых лимфоцитов. Вместе с тем в узелках УСК появляются картины митозов и увеличивается содержание бластов (в центре в 2,5 раза, до 1,0±0,39 клеток; p=0,048). У НСК в узелках появляются плазмобласты и увеличивается количество плазмоцитов (в центре в 9 раз, до 0,9±0,23 клеток; p=0,007). Содержание деструктивно измененных клеток в узелках растет лишь у НСК (в 1,7 раза в основании, до 5,3±0,42 клеток; p=0,007). Как видно, на 3-и сутки инсульта наблюдаются наиболее глубокие изменения в лимфоидных узелках трахеи. Следует отметить, что структурные изменения сосудов и нейронов на 3-и сутки экспериментального инсульта также наиболее выражены на 3-и сутки эксперимента [10]. При этом как в случае с лимфоидными узелками трахеи, так и в ткани мозга обнаруживаются признаки начинающейся компенсации патологических процессов.
На 7-е сутки инсульта у УСК и НСК общее количество клеток лимфоидного ряда увеличивается в верхушке лимфоидных узелков по сравнению с 3-ми сутками соответственно в 1,24 раза — до 33,6±2,05 клеток (p=0,016) и в 1,27 раза до 36,7±1,22 клеток (p=0,002). Количество малых лимфоцитов растет в 1,46 раза — до 14,8±1,06 клеток у УСК и в 1,28 раза — до 16,9±0,8 клеток (p=0,036) у НСК. При этом у УСК растет количество плазматических клеток в узелках (в центре в 8 раз, до 0,8±0,58 клеток; p=0,016). У НСК количество плазматических клеток уменьшается (в основании узелков в 13 раз, до 0,1±0,09 клеток; p=0,030). В целом у УСК на 7-е сутки эксперимента количество малых лимфоцитов в лимфоидных узелках все еще не достигает нормы (в основании в 2,38 раза меньше нормы; p=0,002). При этом у НСК восстановление количества малых лимфоцитов имеет характер гиперкомпенсации (их количество в основании узелков выше нормы в 1, 6 раза (в норме 11,9±0,8 клеток; p=0,04)). У УСК количество малодифференцированных клеток лимфоидного ряда в центре и основании узелка меньше нормы (соответственно в 4 и в 24 раза; p=0,001 и p=0,004). У НСК их количество нормализуется. Количество деструктивно измененных клеток в узелках у УСК меньше, чем в норме (в центре в 2,35 раза; в основании в 1,9 раза; p=0,048 и p=0,045). У НС крыс содержание этих клеток превышает норму (в основании в 2,7 раза, 6,5±0,58 клеток; p=0,001). Таким образом, к 7-м суткам эксперимента у НСК содержание плазматических клеток в узелках меньшее, а малых лимфоцитов и деструктивно измененных клеток большее, чем в норме. У УСК содержание малых лимфоцитов остается несколько меньшим, плазматических клеток — большим, чем в норме (активация гуморального иммунного ответа). Содержание деструктивно измененных клеток в узелках у УСК к 7-м суткам нормализуется. В целом на 7-е сутки эксперимента морфологический и неврологический статусы крыс иллюстрируют срыв компенсаторных процессов, намечающихся на 3-и сутки инсульта у НСК. Необходимо подчеркнуть, что именно в этот период у УСК при морфологическом исследовании сенсомоторной коры были обнаружены признаки, косвенно указывающие на инициацию процессов, направленных на ограничение поражения указанной области головного мозга [8].
Выводы
1. Полученные экспериментальные данные демонстрируют закономерности динамики нейроиммунного взаимодействия при инсульте у крыс с различной устойчивостью к стрессу. Так, на всех сроках эксперимента неврологический дефицит более выражен у НСК, особенно на 1-е сутки наблюдения. При этом на фоне неврологических нарушений в обеих группах крыс отмечается обеднение лимфоидной ткани основными иммунокомпетентными клетками, причем у НСК они выявляются раньше, чем у УСК — также на 1-е сутки инсульта. На 3-и сутки на первый план выходят глубокие изменения клеточного состава лимфоидной ткани, неврологическая симптоматика убывает. К 7-м суткам у НСК происходит срыв компенсаторных процессов: неврологический дефицит нарастает, тренд на восстановление клеточного состава лимфоидной ткани не выявляется. У УСК наблюдается обратная картина: происходит регресс фокальных неврологических симптомов, намечается положительный тренд в компенсации морфологических изменений лимфоидной ткани.
2. Учитывая нейроиммунные взаимодействия в условиях инсульта, коррекция неврологических нарушений может сочетаться с иммуноактивной терапией. Она может быть направлена как на снижение вероятности воспалительных осложнений заболевания, так и на уменьшение отсроченного повреждения мозга в результате аутоиммунной агрессии.
3. В условиях инсульта устойчивость к эмоциональному стрессу — фактор, определяющий выраженность неврологического дефицита и морфологических изменений лимфоидной ткани трахеи крыс. Можно предположить, что применение методик, повышающих стрессоустойчивость у пациентов с факторами риска инсульта, может способствовать снижению частоты осложнений и повышению реабилитационного потенциала пациентов, перенесших инсульт.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.