Болезнь Альцгеймера (БА) — первичное нейродегенеративное заболевание с неуклонно прогрессирующим распадом памяти и других когнитивных функций [1]. На морфологическом уровне характерными патогенетическими признаками БА являются внутри- и внеклеточные отложения амилоидного пептида (Аβ) [2, 3], в том числе вокруг аксонов холинергических нейронов, которые наиболее сильно повреждаются при данном заболевании [4], а также образование нейрофибриллярных клубков гиперфосфорилированного белка тау [5].

Аβ образуется из молекулы более крупного белка, называемого предшественником Аβ (Аmyloid Рrecursor Рrotein — APP), в результате последовательного протеолиза [6, 7] и в нормально функционирующем мозге катаболизируется под действием ряда ферментов, а также связывается с белками-переносчиками и выводится из ткани мозга по периваскулярным путям [8—10]. Данные литературы свидетельствуют о том, что наиболее токсичными для нервных клеток являются растворимые олигомеры Аβ, которые образуют еще более токсичные смешанные комплексы с другими белками, в частности ацетилхолинэстеразой (ЕС 3.1.1.7, АХЭ) [11], а также инициируют образование сенильных бляшек [12]. Мутации в гене АРР, а также белков пресенилинов, которые входят в состав ферментативного комплекса, завершающего образование Аβ из молекулы АРР, приводят к ускоренному образованию и накоплению Аβ и, как следствие, развитию наследуемых семейных форм БА, признаки которой проявляются уже в среднем возрасте. Семейные формы БА составляют около 5% случаев данного заболевания [13]. Большинство же случаев составляет спорадическая форма БА, которая развивается в пожилом и старческом возрасте. Этиология ее возникновения и развития имеет многофакторную природу. Одним из факторов, способствующих возникновению спорадической формы БА, является нарушение катаболизма Аβ и его выведение из нервной ткани [14], часто обусловленное снижением активности амилоид-деградирующих ферментов, в частности неприлизина (EC3.4.24.11, нейтральная эндопептидаза, НЕП) [7, 15, 16], а также нарушением характера связывания Аβ с белками-переносчиками, как, например, в случае экспрессии аллели АроЕ ε4 [17].

Помимо мономеров Aβ(1—40) и его более токсичного варианта Аβ(1—42), НЕП способен также расщеплять их олигомерные формы [18, 19]. В экспериментах на трансгенных мышах было показано, что дефицит экспрессии НЕП приводит к нарушению амилоидного метаболизма и ген-зависимому накоплению эндогенных Aβ(1—40) и Aβ(1—42). Это предполагает, что даже частичное снижение активности НЕП может приводить к накоплению Aβ и развитию БА [20]. В ранее опубликованных исследованиях было показано, что содержание НЕП и его мРНК у больных БА являются достоверно более низкими, чем у пациентов контрольной группы соответствующего возраста [21]. Данные литературы также свидетельствуют о том, что содержание мРНК НЕП и активность его гомолога НЕП2 снижается в средневисочной и среднелобной извилинах, хвостатом ядре и мозжечке головного мозга пациентов с синдромом мягкого когнитивного снижения амнестического типа (а-MКC) и БА [22]. Дефицит активности НЕП в коре и гиппокампе также наблюдается у животных с нарушенными когнитивными функциями [16, 23—27].

На периферии активность НЕП наиболее высока в почках, а также в плазме крови, что делает последнюю удобным объектом для клинических исследований. Было высказано предположение, что уровень Аβ в плазме регулирует его выведение из мозга по периваскулярным путям вследствие существующего баланса его содержания в мозге и на периферии [28]. Из этого следует, что дефицит активности НЕП в плазме может приводить к повышению в ней содержания Аβ и снижению его транспорта из мозга в кровь, обусловливая накопление этого пептида в ткани мозга.

Из данных литературы известно, что при БА наблюдается холинергический дефицит, сопровождающийся снижением активности холинацетилтрансферазы и синтеза ацетилхолина [29]. В то же время активность АХЭ и бутирилхолинэстеразы (ЕС 3.1.1.8, БХЭ) в коре головного мозга и цереброспинальной жидкости в ходе старения и при БА также снижается [30, 31]. При этом в ткани мозга изменяется соотношение активности АХЭ и БХЭ [32, 33]. Также показано наличие прямой корреляции между уровнем активности АХЭ в плазме крови и числом амилоидных депозитов в мозге при БА [34]. Предварительные данные указывают на изменение активности этих ферментов при нарушении когнитивных функций и у животных [35]. Однако комплексного исследования активности описанных ферментов в плазме крови как наиболее доступном для исследования клиническом материале при а-МКC и БА пока не проводилось.

Цель данной работы — исследование активности НЕП, а также АХЭ и БХЭ в плазме крови пожилых людей без нарушений внимания и памяти у пациентов с диагнозами а-МКС и БА, а также оценка влияния лекарственного препарата цераксона (цитиколин) на изменение активности данных ферментов у пациентов с а-МКC.

Исследование проводилось с 2009 по 2013 г. Пациентов наблюдали в амбулаторно-консультативном подразделении Отдела гериатрической психиатрии Научного центра психического здоровья по поводу расстройств памяти и других когнитивных функций. Обследовали также не имеющих таких нарушений пожилых людей — контрольная группа (КГ). Все обследованные дали согласие на участие в тестировании их когнитивных функций и взятие образцов крови для биохимических исследований.

В первые годы нами было проведено исследование активности АХЭ, БХЭ и НЕП в плазме крови пациентов КГ и в группах с диагнозами a-MКC и БА с целью выявления наличия корреляций между активностью этих ферментов и степенью когнитивных нарушений. В дальнейшем изучалось влияние лекарственной терапии с использованием препарата цераксон (цитиколин) на биохимические характеристики плазмы крови пациентов с a-MКC.

Диагноз а-МКC ставили пациентам, соответствовавшим диагностическим критериям синдрома MКC [36] и отвечающим следующим критериям: 1) наличие жалоб на снижение памяти и объективно выявляемые признаки легкого когнитивного снижения по результатам тестов; 2) соответствие III стадии выраженности когнитивного дефицита по шкале общего ухудшения когнитивных функций (Global Deterioration Scale — GDS [37]) и оценке 0,5 по шкале тяжести деменции (Clinical Dementia Rating — CDR [38]); 3) диагноз деменции не может быть поставлен; 4) оценка в диапазоне от 26 до 30 баллов по мини-тесту оценки психического состояния (Mini-Mental State Examination — MMSE [39]) (табл. 1). В данное исследование включались только пациенты с MКC амнестического типа.

Диагностика БА проводилась в соответствии с Международной классификацией болезней 10-го пересмотра (МКБ-10) и Руководством по диагностике и статистике психических расстройств (DSM-IV) [40]. Ключевым критерием диагностики синдрома деменции является наличие множественного прогрессирующего дефицита когнитивных функций, включая нарушения памяти и еще не менее одной из нижеперечисленных функций: мышление, речь, праксис (исполнительная деятельность), гнозис (оптико-пространственная деятельность), нарушающих повседневную активность пациента, существующих не менее 6 мес и не обусловленных какой-либо иной церебральной или внецеребральной патологией. Для оценки когнитивного функционирования больных с a-MКC и БА использовались шкалы ADAS-cog [41] и MMSE [39].

В исследование были включены 39 пациентов в возрасте от 69 до 79 лет. В КГ было 24 человека. Их средний возраст был 69,13±7,52 года (см. табл. 1).

Пациенты из группы а-MКC характеризовались незначительным, но статистически достоверным изменением когнитивных функций по сравнению с контролем: снижением по шкале MMSE до 27,75±0,78 балла и повышением показателя ADAS-cog до 2 баллов. В группе пациентов с диагнозом БА средние значения изменялись еще в большей степени: по шкале MMSE отмечалось снижение до 19,87±5,16 балла, а по ADAS-соg — увеличение до 30,12±16,11 балла, что указывает на выраженный когнитивный дефицит (см. табл. 1).

Пациенты из группы а-MКC отвечали современным критериям диагностики в соответствии с международным протоколом [51]. Для постановки этого диагноза необходимо наличие совокупности ряда критериев, включающих жалобы больного на снижение памяти, подтверждаемые информантом, выраженность когнитивного дефицита в рамках определенных параметров по шкале общего ухудшения когнитивных функций (Global Deterioration Scale — GDS) и шкале тяжести деменции (Clinical Dementia Rating — CDR). При этом повседневная деятельность пациентов должна оставаться сохранной, хотя возможно легкое ухудшение в наиболее сложных видах повседневной и/или профессиональной активности. Согласно современным представлениям, синдром МКС является промежуточной стадией между возрастной нормой и деменцией. Амнестический тип синдрома имеет наибольшую вероятность перехода в БА [36, 52, 53].

Пациенты из группы БА характеризовались выраженными нарушениями памяти и других когнитивных функций, а также значительной утратой возможности повседневного функционирования, свидетельствующими о том, что изменения, произошедшие в ЦНС, уже являются необратимыми; они сопровождаются выраженными нарушениями в различных медиаторных системах, метаболических цепях нервной ткани и массовой гибелью клеток.

Пациенты с а-MКC получали терапию питьевым раствором цераксона (цитиколин) по 1000 мг в сутки в 2 приема в течение 45 дней. Во время терапии цераксоном пациенты не принимали препараты, оказывающие модулирующее действие на состояние когнитивных функций, в том числе ингибиторы АХЭ, антагонисты NMDA-рецепторов, пептидные препараты, антиоксиданты, ноотропы, нейролептики или антидепрессанты. До начала и после окончания курса лечения цераксоном все пациенты проходили тестирование по следующим шкалам и тестам: тест рисования часов [42], субтест «Звуковые ассоциации» из шкалы деменции Маттиса [43] и Бостонский тест называния [44]. Соответствующие результаты представлены в табл. 2.

Забор крови у пациентов для ферментного анализа проводили в вакуумные пробирки с антикоагулянтом и цитратным буфером (pH 5,7) или без буфера (в случае определения активности АХЭ и БХЭ) и центрифугировали при 2000 g 15 мин при 20 °C. Супернатант отбирали и центрифугировали вторично при 9000 g 20 мин при 4 °C. Полученную плазму разделяли на аликвоты по 100 мкл, замораживали (–20 °С) и направляли на дальнейшее исследование. Образцы транспортировали в холодильнике при температуре –20 °С и хранили до исследования активности ферментов в низкотемпературном холодильнике (–80 °С). Согласно имеющимся данным, при таких условиях хранения исследуемые ферменты остаются стабильными и сохраняют активность в течение нескольких месяцев [45] и даже при хранении в течение 3—4 мес в среднем теряется не более 30% ферментативной активности [46].

Определение активности холинэстераз плазмы крови. Активность холинэстераз (АХЭ и БХЭ) определяли по методу Эллмана [47] в 96-луночных планшетах в присутствии синтетических субстратов: ацетилтиохолина или бутирилтиохолина (АТХ, БТХ, 100 мМ; «Sigma», UK). Для оптимизации скорости протекания реакции и регистрации активности ферментов в автоматическом режиме плазму крови разбавляли в 30 раз. В каждую лунку планшета вносили до 40 мкл исследуемых образцов плазмы крови и инкубационную среду, содержащую 2 мМ DTNB в 200 мМ Na-фосфатном буфере (рН 7,5). С целью исключения участия БХЭ в гидролизе АТХ при определении активности АХЭ в исследуемые образцы добавляли селективный ингибитор БХЭ этопропазин (20 мкM; «Sigma», UK). Пробы выдерживались в течение 20 мин при комнатной температуре для развития окраски, после чего реакцию останавливали добавлением 0,0125 мл 3% раствора доцилсульфата натрия (SDS). В параллельные контрольные пробы SDS добавляли заранее (до добавления субстрата). Оптическую плотность измеряли на планшетном спектрофотометре (Mindray Reader MR-96A, Китай) при длине волны 405 нм. Калибровочная кривая строилась при использовании цистеина в качестве стандарта. Результаты представлены в величинах удельной активности фермента (нмоль АТХ/мг белка×мин или нмоль БТХ/мг белка×мин) или общей активности (нмоль субстрата/мл плазмы×мин).

Флуориметрический метод определения активности НЕП плазмы крови. Активность НЕП определяли методом двухступенчатого энзиматического анализа с использованием флуоригенного синтетического субстрата сукцинат-аланин-аланин-фенилаланин-7-амидо-4-метилкумарин (АМС, «Sigma»). НЕП расщепляет данный субстрат между аланином и фенилаланином [48], и для последующего высвобождения флуорофора использовали лейцин-аминопептидазу. Реакцию проводили при комнатной температуре и измеряли флюоресценцию высвобождающегося в ходе энзиматической реакции агента с помощью непрерывной детекции на флуориметре (Ascent Fluoroscan, Thermo Scientific, Финляндия) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 460 нм. Анализируемые пробы добавляли в лунки 96-луночного планшета, в которые предварительно вносили реакционную смесь объемом 100 мкл, состоявшую из 50 мM HEPES буфера, 200 мM NaCl (pH 7,2) и 4 миллиединиц лейцинаминопептидазы (ЛАП, «Sigma»). Активность НЕП определялась по разнице между флюоресценцией продукта, полученного в результате инкубации анализируемых проб без и в присутствии специфического ингибитора НЕП тиорфана (10 мкМ) [49]. Линейность реакции образования продукта оценивалась с помощью флюориметрии в присутствии избыточных количеств ЛАП, необходимых для создания условий, в которых скорость реакции лимитируется только присутствием анализируемого НЕП.

Определение количества белка. Количество белка в пробах плазмы крови определяли методом, основанным на связывании красителя кумасси синий G-250 с заряженными аминокислотами белков в биологических жидкостях [50]. Образование окрашенного комплекса заканчивается через 2 мин после добавления красителя в среду, и его окраска стабильна в течение 1 ч. В ходе определения к аликвоте исследуемой фракции (10 мкл) добавляли 90 мкл реактива Бредфорд и интенсивность окраски измеряли фотометрированием при длине волны 595 нм. Стандартная кривая строилась с использованием γ-глобулина (1 мг/мл).

Статистический анализ данных проводился с использованием программы Microsoft Office Excel 2007 с надстройками для проведения дисперсионного анализа ANOVA. Результаты представлены в виде значения среднего ± ошибка среднего. Достоверность отличий оценивалась с использованием t-критерия Стьюдента, различия считались значимыми при p<0,05. Расчеты по терапевтическим группам проводились с использованием критерия Вилкоксона.

При анализе биохимических показателей было выявлено, что удельная активность НЕП в плазме крови в КГ в среднем составляла 1,770±0,124 нмоль субстрата (АМС)/мг белка×мин (рис. 1), а общая — 132,7±7,3 нмоль/мл плазмы×мин (табл. 3), что сопоставимо с данными литературы, полученными при анализе крови у здоровых и пациентов с другим типом заболевания [54]. В исследованных нами группах пациентов с когнитивными нарушениями наблюдалось статистически достоверное снижение общей активности НЕП, коррелирующее со степенью развития деменции и когнитивным дефицитом, определяемым по шкалам MMSE и ADAS-соg (см. табл. 1). При анализе удельной активности было обнаружено, что в группе с диагнозом a-MКC уровень активности НЕП был в среднем ниже на 19% (p<0,05) и составлял 1,428±0,057 нмоль/мг белка×мин. У пациентов с диагнозом БА активность НЕП была ниже, чем в КГ, в среднем на 42% и составляла 1,028±0,086 нмоль/мг белка×мин (см. рис. 1). Это указывает на то, что при развитии мягкого когнитивного снижения существует постоянный дефицит этого фермента в течение длительного времени, что может приводить к существенному изменению баланса метаболизма и накоплению Аβ в разных органах и тканях, включая мозг. Это в свою очередь может приводить к нарушению деятельности нервных клеток и их гибели, что является предпосылкой развития нейродегенеративных изменений и когнитивного дефицита. Наши данные также свидетельствуют, что при БА дефицит активности НЕП усугубляется. Существенное снижение активности НЕП может не только усилить накопление Аβ, но и привести к нарушению структуры мозга, межклеточного взаимодействия, метаболизма ряда нейротрансмиттеров и ухудшению памяти [23—26]. Полученные нами данные по изменению активности НЕП в плазме крови у лиц с a-MКC и БА сходны с данными по изменению активности этого фермента в теменной и фронтальной коре головного мозга у аналогичных групп пациентов [22].

Согласно полученным данным, основная холинэстеразная активность крови обусловлена наличием в плазме БХЭ, поскольку уровень общей активности этого фермента на 1—2 порядка выше, чем АХЭ (см. табл. 3). Это наблюдение соответствует имеющимся представлениям о свойствах АХЭ как мебраносвязанного фермента, локализованного в виде GPI-заякоренной формы в мембранах форменных элементов крови [55, 56], в то время как БХЭ является растворимым ферментом, выполняющим важную защитную функцию в организме [57]. Cогласно нашим данным, средняя удельная активность БХЭ у пациентов КГ составляла 0,210±0,017 нмоль БТХ/мг белка×мин, а АХЭ — 0,009±0,0005 нмоль АТХ/мг белка×мин (рис. 2, 3). Активность БХЭ в плазме крови пациентов с диагнозом а-MКC была достоверно ниже (на 15%) контрольных величин и составляла 0,179±0,009 нмоль БТХ/мг белка×мин. В плазме крови пациентов с БА снижение активности БХЭ было еще более выраженным: на 33% от контрольных величин и на 22% от значений активности при а-MКС (см. рис. 3). Изменение активности АХЭ у пациентов с разной степенью развития когнитивного дефицита имело сходный характер. Так, в группе а-MКC активность АХЭ была ниже на 33%, чем в КГ, а при БА ее уровень не превышал 34% от контрольных величин (см. рис. 2). Сходные изменения были продемонстрированы также при сравнении величин общей активности исследованных холинэстераз, выраженных в нмолях превращенного субстрата на мл плазмы в минуту (см. табл. 3). Более выраженное снижение активности АХЭ и БХЭ в плазме крови пациентов с БА может быть объяснено тем, что у пациентов с а-MКC патологические изменения еще не достигают степени тяжести деменции и являются в той или иной мере обратимыми, в то время как у пациентов с БА уже наступили необратимые метаболические изменения, приводящие в том числе к нарушению функционирования ферментов различных медиаторных систем.

При лечении пациентов с а-MКC препаратом цераксон (цитиколин), в отличие от группы получавших плацебо, установлены статистически значимое улучшение когнитивного функционирования больных по тесту «Звуковые ассоциации» и Бостонскому тесту называния (см. табл. 2) и повышение относительной активности НЕП, АХЭ и БХЭ в плазме крови. Так, в результате проведенного лечения активность НЕП повышалась на 40% по сравнению с пациентами, получавшими плацебо (см. рис. 1), активность АХЭ — на 33% (см. рис. 2), а активность БХЭ — на 19% (см. рис. 3).

Отмеченные изменения активности исследованных ферментов при лечении цераксоном отражают положительную динамику у пациентов с а-МКС в отношении ряда показателей их когнитивного функционирования. Эти данные также хорошо согласуются с результатами проведенного ранее клинического исследования [58], что свидетельствует о возможности восстановления на этом вероятном додементном этапе БА свойств нервной системы, а также исследуемых ферментов плазмы крови до показателей возрастной нормы при использовании лекарственного препарата цераксон у пациентов с a-MКC. Полученные результаты также согласуются с данными литературы о том, что цераксон способен восстанавливать холинергическую передачу в раннем постинсультном периоде [59], а также эффективен при лечении когнитивных расстройств [58, 60], однако воздействие данного препарата на исследуемые нами ферменты показано впервые.

Цераксон (цитиколин, цитидин-5-дифосфохолин, CDP-холин, ЦДФ-холин) является предшественником фосфатидилхолина (лецитин), основного структурного компонента всех клеточных мембран, включая нейрональные мембраны. Согласно результатам многочисленных исследований [61], к основным эффектам цераксона относят активацию биосинтеза таких липидов мозга, как фосфатидилхолин, кардиолипин и сфингомиелин, играющих важную роль в нормальном функционировании нейрональных мембран. Более того, он принимает прямое участие в синтезе ацетилхолина, стимуляции синтеза глутатиона, а также в ингибировании процессов перекисного окисления липидов, что в большой степени обусловливает активность клеточных ферментов. Благодаря этому цераксон успешно применяется для защиты и восстановления нервной ткани при ишемии и инсультах [62]. Имеются доказательства того, что цераксон также влияет на отложение Аβ и уменьшает гибель нейронов в гиппокампе крыс, вызванную инъекцией Аβ [63]. В результате многие исследователи рассматривают это соединение как эффективное средство для лечения различных форм нейродегенерации, включая БА [60, 64]. Высказано предположение [65], что цитиколин может модифицировать активность холинэстераз как путем непосредственного воздействия на активный центр ферментов, так и через изменение их микроокружения в клеточных мембранах.

Полученные нами данные также свидетельствуют о том, что курсовой прием цераксона восстанавливает уровни активности НЕП, АХЭ и БХЭ в плазме крови, сниженные в результате патологических процессов, приводящих к нарушению памяти и когнитивному дефициту.

В заключение следует подчеркнуть, что уровни активности НЕП, АХЭ и БХЭ могут потенциально служить преклиническими маркерами МКС и БА и использоваться для оценки динамики развития а-МКС и эффективности применяемых терапевтических препаратов. Однако для внедрения этих критериев в практику требуется дополнительное усовершенствование используемых энзиматических тестов.

Конфликт интересов отсутствует.

Исследование выполнено при поддержке Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине» (№ 5, 2009—2014 гг.); РФФИ 13−04−00338.