Вопрос патогенетической терапии лейомиомы, наиболее часто встречающейся гормонально-зависимой опухоли матки, и в настоящее время остается актуальным в связи с частотой распространения, многофакторностью этиологии и патогенеза. Проблема актуальна, поскольку речь идет о тактике лечения пациенток репродуктивного возраста, которое преимущественно должно иметь органосохраняющий характер с целью сохранения и восстановления фертильности [1—3].

В патогенезе роста лейомиомы важную роль играют как эстрогены, так и прогестероны, а также их рецепторы. Под воздействием прогестерона повышается синтез факторов роста, а эстроген увеличивает экспрессию их рецепторов [5]. Согласно данным различных исследований, отмечено более высокое содержание рецепторов прогестерона по сравнению с эстрогеновыми рецепторами в миоматозных узлах. Также уровень прогестероновых рецепторов значительно выше в лейомиоме, чем в прилежащем миометрии [6—8]. Выявлено, что в секреторную фазу менструального цикла под воздействием прогестерона повышается пролиферация в лейомиоцитах, а активность апоптоза снижается, что способствует активному росту миоматозных узлов [6]. Исследования патогенеза и морфогенеза миомы матки показали, что для миоматозных узлов характерны нарушение процессов пролиферации и апоптоза лейомиоцитов, а также дисбаланс между ингибиторами и активаторами ангиогенеза [9—12].

Единственным радикальным методом лечения миомы матки является гистерэктомия. Однако у женщин репродуктивного возраста преимущественно требуется проведение органосохраняющих операций. Миомэктомия нередко бывает сопряжена с техническими сложностями, требующими проведения предварительной предоперационной подготовки.

Новым препаратом, учитывающим патогенетическую основу развития миомы матки, является селективный модулятор прогестероновых рецепторов (СМПР) улипристала ацетат (УА), оказывающий антипролиферативное и проапоптотическое действие на лейомиоциты. Препарат обратимо блокирует прогестероновые рецепторы в тканях-мишенях, имеет минимальное сродство к рецепторам андрогенов, эстрогенов и минералокортикоидов, подавляет экспрессию факторов роста и ангиогенеза [15, 16]. УА проявляет свойства как антагонистов, так и агонистов прогестероновых рецепторов [17]. Под влиянием СМПР возникают изменения конфигурации прогестероновых рецепторов, позволяющие взаимодействовать с корепрессорами (NCoR). В то же время под воздействием СМПР рецепторы прогестерона связываются и с коактиваторами (SRC), что не происходит при взаимодействии с чистыми антагонистами [6, 7, 17].

В 2012 г. группой исследователей проведено два мультицентровых рандомизированных клинических исследования (PEARL I, PEARL II), доказавших высокую эффективность УА в качестве предоперационной подготовки пациенток с миомой матки, сопровождающейся меноррагией и хронической постгеморрагической анемией [19, 20]. В настоящее время препарат широко используется в основном на этапе предоперационной подготовки пациенток с лейомиомой. Однако в 2014 и 2015 гг. J. Donnez и соавт. опубликовали результаты мультицентровых клинических исследований (PEARL III, PEARL IV), в которых рассматривается длительное использование УА, в том числе и с целью отмены оперативного вмешательства. На данный момент продолжается изучение расширения возможностей использования препарата. Так, уже проведены небольшие исследования, в которых длительность терапии УА доходила до 8 курсов. Однако в настоящее время представлено мало фундаментальных исследований, объясняющих молекулярные и структурные изменения, лежащие в основе редукции размера опухоли. В связи с этим актуальным является изучение молекулярно-биологического влияния УА на ткань миоматозных узлов.

Цель исследования — изучить молекулярные механизмы и морфологический субстрат редукции лейомиомы матки у пациенток репродуктивного возраста, получавших СМПР УА в течение 3 мес, на основании оценки иммуногистохимической экспрессии SRC-1, NCoR-1, ER, PGR, Ki-67, p16, TGF-β, VEGF в ткани опухоли.

Обследованы 75 женщин репродуктивного возраста с лейомиомой, сопровождающейся меноррагией и анемией на базе отделения оперативной гинекологии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. 1-я группа (основная) — 40 пациенток, которым перед оперативным вмешательством проводилась медикаментозная терапия УА в дозе 5 мг в течение 3 мес, а затем — лапароскопическая миомэктомия (средний возраст пациенток 37,2±4,8 года). Медикаментозная терапия назначалась с учетом проведенного обследования: стандартные общеклинические исследования, цитологическое исследование соскобов шейки матки, УЗИ органов малого таза, CA125 при необходимости. В связи с эффектом УА, оказываемым на эндометрий и выраженным неспецифическими морфологическими изменениями, в обязательном порядке пациенткам 1-й группы проводилась пайпель-биопсия эндометрия до лечения и через 6 мес после завершения терапии. 2-я группа (контрольная) — 35 пациенток, которым оперативное вмешательство производилось без предварительной медикаментозной терапии (средний возраст 37,8±4,21 года). Всем пациенткам на этапе первичного осмотра проведены стандартное общеклиническое обследование, инструментальные и лабораторные исследования. Каждая пациентка подписывала информированное согласие.

Всем пациенткам выполнена лапароскопическая миомэктомия с использованием соответствующей аппаратуры фирмы «Karl Storz» (Германия). Проведена сравнительная оценка основных критериев течения операции и послеоперационного периода в двух группах.

Выполнены макроскопическое, морфологическое и иммуногистохимическое исследования миоматозных узлов, полученных в 1-й и 2-й группах путем электромеханической морцелляции во время лапароскопии. Исследование проводилось на базе 1-го патологоанатомического отделения ФГБУ НЦАГиП им. В.И. Кулакова Минздрава России и кафедры патологической анатомии им. акад. А.И. Струкова ФГБОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России, 2014—2016 гг. Образцы тканей фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 ч. Далее обрабатывали материал по стандартной методике, затем заливали в парафин, изготавливали срезы толщиной 4—5 мкм с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином. Для иммуногистохимического исследования были подготовлены неокрашенные депарафинированные срезы толщиной 4 мкм. В исследовании использовали следующие антитела: к ER-α (RTU, Dako), к PgR (RTU, «Dako»), Ki-67 и антионкогену p16 (метод двойного окрашивания — kit CIN tec PLUS, «Roche»), корепрессорам ядерных рецепторов NCoR (1:200, «ThermoFisher Scientific»), коактиваторам стероидных рецепторов SRC-1 (1:300, «ThermoFisher Scientific»), VEGF (1:100, «Abcam»), TGF-β (1:1000, «Thermo Scientific»). Степень выраженности экспрессии ER, PgR, SRC-1, NCoR-1 оценивали по системе HistoScore по количеству и интенсивности окрашенных ядер лейомиоцитов: до 80 низкая, 80—140 умеренная, 141—300 выраженная экспрессия. В оценке экспрессии p16, Ki-67, VEGF, TGF-β использовали полуколичественный балльный метод подсчета: до 10% окрашенных клеток — 1 балл, 10—20% — 2 балла, 20—40% — 4 балла и более 40% — 6 баллов (1—2 — низкая, 3—4 — умеренная, 5—6 — высокая экспрессия).

Статистический анализ полученных данных выполняли с использованием программного обеспечения MS Office Excel и Statistica for Windows 10.0 с помощью определения критерия Стьюдента (для анализа данных результатов клинического исследования), а также непараметрического анализа по Манну—Уитни (для анализа результатов морфологического и иммуногистохимического исследований). Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

При анализе исходной клинико-лабораторной характеристики в обеих группах не выявлено статистически значимых различий. Все пациентки жаловались на обильные менструации. Степень тяжести менструальной кровопотери определялась в баллах по графической шкале оценки кровопотери (PBAC) в среднем составила 341,4±84,7 и 359,6±91,5 в 1-й и 2-й группах соответственно. У всех пациенток отмечено снижение уровня гемоглобина, в среднем составившего 94,3±12,7 и 101,5±8,7 г/л в 1-й и 2-й группах. По данным эхографии в обеих группах преобладало наличие множественных миоматозных узлов с центрипетальным ростом одного или нескольких из них. После анализа исходной клинико-лабораторной характеристики пациенткам 1-й группы с целью предоперационной подготовки назначалась медикаментозная терапия УА в дозе 5 мг в течение 3 мес. Перед проведением лечения всем пациенткам основной группы проводилась пайпель-биопсия слизистой полости матки. По данным гистологического исследования ни у одной пациентки не обнаружено гиперпластических процессов в эндометрии.

После проведенной медикаментозной терапии в 1-й группе у всех женщин отмечалось значительное уменьшение менструальных кровотечений уже в 1-й месяц приема У.А. Кровотечение останавливалось в среднем через 5,3±1,12 дня с момента начала лечения. Повышение уровня гемоглобина в основной группе после терапии отмечалось у всех женщин: среднее значение составило 123,4±11,2 г/л в 1-й группе и 100,2±13,4 г/л в группе контроля (p<0,01). Размер доминантных миоматозных узлов уменьшился практически у всех пациенток на 25% (Δ=–1,8 см) и составил в среднем 6,25±2,2 см (p<0,05). В контрольной группе по данным эхографии размер доминантного узла в среднем составил 7,1±2,09 см [18]. Полученные выше результаты в 1-й группе сопоставимы с результатами других авторов [19, 20] и позволяют сделать вывод о клинической эффективности УА.

После миомэктомии лапароскопическим доступом проведен сравнительный анализ интраоперационных и послеоперационных параметров в обеих группах, представленный в табл. 1.

В 1-й группе отметилось снижение длительности операции (p=0,043), объем кровопотери в среднем составил 160±159,7 мл, в группе контроля — 230,5±213,6 мл (p=0,021). Уровень гемоглобина на 2-е сутки после операции был статистически значимо выше в 1-й группе пациенток (p=0,04).

Интраоперационно отмечено уменьшение размера доминантных миоматозных узлов в 1-й группе (p=0,032). По количеству и типу узлов достоверных различий в обеих группах не выявлено; преобладали множественные межмышечные узлы с центрипетальным ростом.

При гистологическом исследовании ткани эндометрия, полученной путем пайпель-биопсии до лечения и через 6 мес после завершения терапии, а также интраоперационно путем диагностического выскабливания, ни у одной пациентки не выявлено гиперпластических и злокачественных процессов в слизистой полости матки, что согласуется с данными ранее проведенных исследований [16, 21].

При макроскопическом исследовании лейомиомы, удаленные путем электромеханической морцелляции, имели светло-серый цвет, плотноэластическую консистенцию, масса их составила 40—710 г (в среднем в 1-й группе 177,3±125,8 г, во 2-й группе 168,6±105,8 г). На разрезе узлы имели слоистое строение, с поверхности узла соскоб не получен. Лейомиомы в основной и контрольной группах практически не имели структурных отличий.

При гистологическом исследовании миоматозных узлов во всех случаях выявлено строение по типу простой лейомиомы тела матки с различными вторичными изменениями (гиалиноз, склероз, очаговый отек стромы). В табл. 2 представлена сравнительная характеристика морфологических особенностей лейомиомы в обеих группах. В 1-й группе отмечалось вариативное строение опухоли, в большинстве случаев характеризовавшееся наличием участков гиалиноза (75%) и склероза (72,5%) стромы и атрофии (62,5%) лейомиоцитов (рис. 1, а). Во 2-й группе данные морфологические особенности встречались достаточно редко, а склероз стромы не обнаруживался. Также в 1-й группе практически во всех случаях выявлено утолщение и уплотнение стенок артерий в строме узлов (90%) в виде гиалиноза и склероза, признаки апоптоза лейомиоцитов обнаружены в 78% наблюдений.

Таким образом, полученные клинические данные об уменьшении размера лейомиомы после проведенной медикаментозной терапии СМПР подтверждены результатами гистологического исследования, выявившими, что морфологическим субстратом частичной редукции опухоли явились гиалиноз и склероз стромы, апоптоз и атрофия лейомиоцитов, дистрофические изменения лейомиоцитов, а также трофические расстройства, проявляющиеся в уплотнении и утолщении стенок артериол, сужении их просвета. Полученные результаты согласуются с данными литературы [21, 22].

В лейомиоме изучена экспрессия регуляторов гормональной рецепции (SRC-1, NCoR-1), рецепторов стероидных гормонов (PgR, ER) и факторов, регулирующих рост и ангиогенез (p16, Ki-67, VEGF, TGF-β).

Особый интерес представляло изучение маркеров, регулирующих стероидную рецепцию: коактиваторов стероидных рецепторов SRC-1 и корепрессоров ядерных рецепторов NCoR-1. Вышеперечисленные корегуляторы тесно связаны с активностью рецепторов стероидных гормонов [23], играют роль во взаимодействии с максимальным количеством ER и PgR в ткани матки. При взаимодействии с коактиваторами SRC-1 активируется транскрипция PgR [24], что проявляется в действии УА как агониста. Однако препарат обладает также и свойствами антагонистов рецепторов прогестерона, что проявляется в изменениях конформации PgR, способствующих их взаимодействию с корепрессорами NCoR [23]. При сравнительном анализе результатов в 1-й группе отмечалось статистически достоверное снижение уровня экспрессии коактиваторов стероидных рецепторов SRC-1 по сравнению с контрольной группой (p=0,0071) (см. рис. 1, б, в; рис. 2, а). При оценке экспрессии корепрессоров ядерных рецепторов NCoR-1 не выявлено достоверных различий в исследуемых группах (p=0,3) (см. рис. 1, г; рис. 2, а). Среднее значение составило 66,3±16,4 и 61,6±21,2 в 1-й и 2-й группах соответственно. Полученные данные подтверждаются результатами исследования T. Maruo и соавт. [5] и показывают уменьшение пролиферации и увеличение апоптоза в лейомиомах под действием СМПР. В проведенном исследовании отмечается достоверное снижение экспрессии коактиватора SRC-1 с сохранением уровня корепрессора NCoR-1 в ядрах лейомиоцитов в 1-й группе. Эти результаты показывают, что УА в миоматозных узлах в большей степени действует как антагонист прогестероновых рецепторов, что клинически проявлялось в уменьшении размеров опухоли.

Известно, что в патогенезе развития лейомиомы участвуют эстрогены и прогестерон, а также их рецепторы [3, 5]. Под воздействием половых стероидов повышается синтез факторов роста, усиливается пролиферация в миоматозных узлах, снижается апоптоз [5]. В нашем исследовании экспрессия PgR была умеренно выраженной и в среднем составила 148,1±26 и 144,4±15,2 в 1-й и во 2-й группах соответственно (p=0,536). Средний показатель экспрессии ER-α был низкий, составил 56±25,8 в 1-й группе и 67,6±18,9 во 2-й группе (p=0,2). По результатам проведенного иммуногистохимического исследования не выявлено статистически значимых различий в экспрессии прогестероновых и эстрогеновых рецепторов в обеих группах (см. рис. 2, а).

Была изучена экспрессия белка гена-супрессора опухолевого роста p16, являющегося регулятором клеточного цикла. Этот белок ингибирует ферменты из группы циклинзависимых киназ и при определенной концентрации блокирует переход клетки из фазы покоя (G0) в фазу деления (S) [25, 26]. В нашем исследовании распределение экспрессии антионкогена p16 было равномерно низким в обеих группах. В 1-й группе данный показатель был несколько выше, чем в контроле, и составил 2,6±1,5 и 1,4±1,3 балла в лейомиоцитах и эндотелии (p=0,035) против 0,72±0,4 и 0,62±0,2 балла соответственно во 2-й группе (см. рис. 1, д; рис. 2, б). Эти данные косвенно указывают на усиление апоптоза и снижение пролиферативной активности в основной группе, что также подтверждает результаты гистологического исследования.

Основным маркером для оценки пролиферативной активности клеток является ядерный антиген Ki-67 [27]. Определение его уровня экспрессии позволяет выделить клетки, находящиеся в активной фазе клеточного цикла на всем его протяжении [28]. В 1-й группе отмечалась крайне низкая экспрессия Ki-67 (0,17±0,15%) по сравнению с контрольной группой (0,38±0,1%) (p<0,0001), что указывает на понижение пролиферативной активности в узлах после проведенной терапии УА (см. рис. 1, д; рис. 2, в). В исследованиях многих авторов указывается на снижение пролиферации в лейомиоме под воздействием СМПР, в том числе и УА, что подтвердилось и в представленном исследовании [17, 29].

Для оценки ангиогенеза в миоматозных узлах проведено изучение экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF. Под воздействием сигнальных белков семейства VEGF происходит стимуляция многочисленных проангиогенных факторов [30]. При высокой экспрессии VEGF в опухолях происходит снижение апоптоза эндотелия, что способствует активному неоангиогенезу [30, 31]. В нашем исследовании в миоматозных узлах выявлено значительное снижение экспрессии маркера VEGF в лейомиоцитах и в эндотелии в 1-й группе по сравнению с контрольной группой (p<0,001) (см. рис. 1, е; рис. 2, г). Среднее значение показателя составило в лейомиоцитах 1,3±1,1 и 2,6±1,5 балла, в эндотелии 1,5±0,8 и 3,4±1,7 балла в 1-й и 2-й группах соответственно.

Была изучена экспрессия трансформирующего фактора роста TGF-β в ткани миоматозных узлов. Известно, что белки семейства TGF-β инициируют апоптоз практически во всех типах клеток (особенно эпителиальных и эндотелиальных), а также подавляют определенные гены, ответственные за переход клеток из G1- в S-фазу клеточного цикла [32]. Эти процессы лежат в основе механизмов супрессии роста опухолей. Однако TGF-β может активировать эпителиально-мезенхимальную трансформацию опухолевых клеток и прогрессию рака [33]. Также TGF-β способен повышать экспрессию VEGF, что усиливает ангиогенез [34]. В обеих группах отмечена умеренная и высокая экспрессия TGF-β в эндотелии миоматозных узлов (3,6±1,17 и 5,12±1,01 в 1-й и 2-й группах) и преимущественно низкая в лейомиоцитах (1,26±1,4 и 2,04±1,5 в 1-й и 2-й группах). При сопоставлении полученных результатов в 1-й группе уровень экспрессии TGF-β был несколько ниже (p<0,05) (см. рис. 2, д).

Полученные результаты иммуногистохимического исследования подтверждают данные морфологического исследования. Частичная редукция лейомиомы под воздействием СМПР происходит за счет повышения экспрессии антионкогена p16 и снижения маркера пролиферации Ki-67 почти в два раза в основной группе по сравнению с группой контроля, выраженного снижения VEGF, что приводит к снижению ангиогенеза, уменьшению экспрессии TGF-β. Важным результатом иммуногистохимического исследования гормональной регуляции миоматозных узлов стало выявление снижения экспрессии коактиваторов стероидных рецепторов SRC-1 в ткани опухоли при относительно неизмененной сниженной экспрессии PgR и умеренной экспрессии ER, а также при сохраненном уровне экспрессии корепрессоров ядерных рецепторов NCoR-1. Полученные данные указывают на то, что СМПР в миоматозных узлах действуют в большей степени как антагонисты прогестероновых рецепторов.

На фоне медикаментозной терапии УА у пациенток репродуктивного возраста с миомой матки прекращались обильные менструальные кровотечения, отмечалось стойкое повышение уровня гемоглобина, уменьшение размера миоматозных узлов. Все вышеперечисленное создало благоприятные условия для применения лапароскопического доступа во время хирургического вмешательства.

Морфологическим субстратом и молекулярными механизмами редукции лейомиомы у пациенток репродуктивного возраста под воздействием СМПР явились апоптоз и дистрофия лейомиоцитов, склероз и гиалиноз стромы опухоли со снижением экспрессии Ki-67 и повышением р16 в гладкомышечных клетках, трофические расстройства в ткани узлов, проявляющиеся склерозом сосудистой стенки и снижением экспрессии VEGF и TGF-β, а также дисрегуляцией гормональной рецепции лейомиоцитами под воздействием препарата, проявляющейся в снижении экспрессии коактиваторов стероидных рецепторов SRC-1 при неизмененной экспрессии PR и ER и сохранении уровня корепрессоров ядерных рецепторов NCoR-1.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Т.А.Д., З.В.Р., Е.А.К., Л.В.А.

Сбор и обработка материала: Т.А.Д., З.В.Р.

Статистическая обработка: З.В.Р.

Написание текста: Т.А.Д, З.В.Р., Е.А.К

Редактирование: Т.А.Д., Е.А.Д.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.