Актуальность работы объясняется персистенцией вируса в популяции, серьезным влиянием на экономическое благополучие и состояние здравоохранения всей планеты. Количество заболевших SARS-CoV-2 по всему миру составляет более 181 млн человек (на 29.06.21), из которых более 3,9 млн скончались (процент летальности 2,1) [1]. Несмотря на относительно низкую летальность, из-за высокой скорости распространения была объявлена пандемия, продолжающаяся и по сей день.
Заражение происходит преимущественно воздушно-капельным путем, однако описаны и другие механизмы распространения вируса. Основным органом-мишенью являются легкие, в которые вирус проникает с помощью Spike-протеина (S-протеина) через ангиотензинпревращающий фермент 2 (АПФ-2), хотя пути внедрения вируса в клетку этим не ограничиваются.
Достаточно новым направлением в исследованиях являются внеклеточные везикулы (ВКВ), которые принимают участие не только во многих физиологических процессах, но и в патогенезе различных заболеваний, включая COVID-19 [2, 3]. Однако исследований, достоверно показывающих роль ВКВ в развитии COVID-19, еще недостаточно, но их изучение позволит лучше понять молекулярные механизмы патогенеза не только COVID-19, но и других заболеваний.
Этиология
Коронавирус, вызывающий тяжелый острый респираторный синдром (SARS-CoV-2), — это ранее неизвестный бета-коронавирус, который был обнаружен в образцах бронхоальвеолярного лаважа, забор которого был выполнен у групп пациентов с пневмонией неизвестной этиологии в городе Ухань в декабре 2019 г. [4, 5]. SARS-CoV-2 представляет собой плеоморфный, оболочечный, положительный одноцепочечный РНК-вирус с размером вириона примерно 80—120 нм в диаметре [6—8]. Название вируса следует из его внешнего вида, напоминающего солнечную корону. В состав коронавируса входит крупная молекула РНК, одна из самых крупных, которые известны человечеству, а также 4 основных белка: S — спайковый, E — оболочечный, M — мембранный и N — нуклеокапсидный [9].
Большинство пациентов, изначально пострадавших во время вспышки, сообщали о связи с Южно-Китайским рынком морепродуктов Хуанань, что указывает на зоонозное происхождение вируса [10]. До 2002 г. считалось, что коронавирусы обладают тропизмом только к животным, однако впоследствии было показано, что они могут стать причиной острого респираторного заболевания у человека [11]. Коронавирусы классифицируются на альфа, бета, гамма и дельта в зависимости от их филогенеза. В настоящее время известно, что в человеческой популяции циркулируют альфа- и бета-коронавирусы, а именно HCoV-229E, -OC43, -NL63 и -HKU1 [12—14]. Помимо вышеуказанных генотипов, бета- коронавирусы включают еще и других возбудителей, некоторые из которых уже вызывали эпидемии в XXI веке (SARS-CoV-1 в 2002 г. и MERS-CoV в 2012 г.) Прежде чем подробно рассматривать патогенез SARS-CoV-2, необходимо проанализировать эпидемии SARS-CoV-1 и MERS-CoV в связи со структурной и молекулярной схожестью этих возбудителей [15].
Каждый из коронавирусов, поражающих человека, может привести к тяжелому поражению респираторного тракта, однако вирулентность и летальность у каждого из вирусов разные. В частности, во время эпидемии SARS-CoV-1 было заражено 8096 человек, из которых 774 случая закончились летально (процент летальности 9,6) (ВОЗ, 2003). Клиническая картина у пациентов напоминала таковую при COVID-19: одышка, кашель, боль в грудной клетке, развитие ОРДС [16]. Во время эпидемии MERS-CoV было выявлено 2502 случая заражения, из которых 861 с летальным исходом (процент летальности 34,4) (ВОЗ, 2019). Ведущие симптомы были похожими: лихорадка, кашель и одышка. У заболевших также развивалась интерстициальная пневмония [17].
На данный момент в популяции циркулирует несколько основных штаммов SARS-CoV-2: британский (B.1.1.7), японский или бразильский (P.1), южноафриканский (B.1.351), индийский и штамм b.1.525, который был выявлен в Эдинбургском университете. Один из мутантов — британский штамм (VOC 202012/01) был выявлен в феврале 2021 г., он имеет предположительно более высокую вирулентность, скорость распространения и смертность. Этот штамм вызывает аналогичные синдромы, сопровождающиеся типичными клиническими проявлениями в виде респираторной симптоматики. В конце марта 2021 г. был зарегистрирован новый штамм — индийский (B.1.617), который стремительно распространяется по всему миру, включая Российскую Федерацию. До сих пор нет опубликованных статей, описывающих достоверные данные о патогенности этого штамма, однако с появлением такой разновидности вируса произошло увеличение показателя смертности на территории Индии [18].
Патогенез
Вирус SARS-CoV-2 распространяется преимущественно воздушно-капельным путем при тесном контакте с больным человеком и бессимптомными носителями [19—22]. Вирусная нагрузка наиболее высока непосредственно перед появлением симптомов и затем в течение первых 5—7 дней болезни [23]. Кроме того, отмечают, что вирус может персистировать на различных поверхностях, это способствует контактному механизму передачи. Описаны исследования, показывающие наличие РНК вируса в плазме крови и кале, что не исключает гемоконтактный и фекально-оральный механизм передачи инфекции, существует также возможность передачи с молоком матери, также были описаны единичные случаи вертикальной передачи вируса [24]. Основными входными воротами для вируса являются эпителий верхних дыхательных путей и эпителиоциты желудка и кишечника.
Цикл жизни вируса SARS-CoV-2 можно разделить на несколько ключевых этапов: прикрепление и проникновение в клетку, транскрипция вирусной репликазы, геномная транскрипция и репликация, трансляция структурных белков, сборка с высвобождением вириона [25]. Вирус SARS-CoV-2, попадая на эпителий верхних дыхательных путей, связывается с ангиотензинпревращающим ферментом 2 (АПФ-2, ACE-2) с помощью поверхностного S (spike) белка [26, 27], что посредством протеаз клетки позволяет вирусу проникать внутрь. ACE-2 расположен на поверхности клеток во многих органах [28]. Более ранние исследования показали, что SARS-CoV-1 имеет те же рецепторы (АПФ-2) проникновения в клетку, что и SARS-CoV-2, однако аффинитет последнего выше [8,15].
Некоторые работы указывают на наличие альтернативного пути внедрения коронавирусов в клетку, который осуществляется при помощи взаимодействия S-протеина вируса с CD147 на поверхности клеток. CD147 широко распространен во всем человеческом организме, а при некоторых заболеваниях (например, при бронхиальной астме и сахарном диабете) его экспрессия увеличена, что объясняет патогенез обострений данных заболеваний при COVID-19 [9].
Существуют работы, в которых было показано, что еще одним альтернативным механизмом проникновения коронавирусов (в частности, MERS-CoV) является взаимодействие S-протеина коронавирусов с дипептидилпептидазой 4 (ДПП4) клетки-мишени, однако полиморфизм ДПП4 негативно влияет на возможность внедрения вируса [29, 30].
В других статьях показано, что еще один белок может являться входными воротами для внедрения вируса внутрь клетки — рецептор тирозинпротеинкиназы UFO (AXL), который специфически взаимодействует с N-концевым доменом SARS-CoV-2. Ученые показали, что избыточная экспрессия AXL в клетках HEK293T способствует проникновению SARS-CoV-2 так же эффективно, как и избыточная экспрессия ACE2, в то время как отключение AXL значительно снижает инфекцию SARS-CoV-2 в легочных клетках H1299 и в первичных эпителиальных клетках легких человека. Уровень экспрессии AXL коррелирует с уровнем SARS-CoV-2 в клетках жидкости бронхоальвеолярного лаважа пациентов с COVID-19. AXL является новым кандидатом для внедрения SARS-CoV-2 в клетку и может играть важную роль в распространении вирусной инфекции дыхательной системы человека. AXL — потенциальная цель для будущих стратегий клинического вмешательства [31].
После клеточного проникновения происходит внедрение нуклеокапсида в цитозоль с дальнейшей транскрипцией вирусной репликазы и генома вируса. Исследования показали, что процесс транскрипции сложен и включает многочисленные прерывистые транскрипционные события, после чего происходят трансляция вирусных белков, сборка вирусных частиц и выведение вируса из клетки [15, 32]. Сборка вируса осуществляется в промежуточном компартменте между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи (ERGIC), где вирус собирается в пузырьки и выводится из клетки. Эти пузырьки являются разновидностью ВКВ.
ВКВ — окруженные двуслойной липидной мембраной структуры диаметром около 20—1000 нм, синтезируются всеми типами клеток эукариот и включают несколько отличающихся по структуре, составу и механизму синтеза подвидов: экзосомы, эктосомы, микровезикулы, апоптозные тельца, онкосомы и др. [2, 33].
Ранее ВКВ считались «мусорщиками» клеток нашего организма, но дальнейшие работы раскрыли широкий спектр процессов, осуществляющихся с их помощью, самый главный из которых — межклеточные коммуникации. ВКВ влияют на судьбу клеток, их морфологию и функцию [3]. В состав ВКВ могут входить белки, углеводы, липиды, ДНК, микроРНК, мРНК, не кодирующие РНК и др. [2]. Кроме того, в везикулах были обнаружены различные цитокины (например, Il-1, TNFα и др.), регулирующие различные процессы в организме. Было показано, что, находясь в везикулах, вещества обладают более высокой активностью [2]. Воздействие ВКВ влияет на судьбу клеток, их морфологию и функцию [3].
Есть несколько путей синтеза и секреции ВКВ. Одним из таковых является выпячивание мембраны в виде пузырька, который отщепляется с помощью белкового комплекса, необходимого для эндосомальной сортировки и транспорта (Endosomal Sorting Complex Required for Transport — ESCRT). Этот механизм неспецифичный, он встречается во многих типах клеток эукариот. Может происходить выпячивание как мембраны клеток, так и интрацитоплазматических мультивезикулярных телец [2]. Важное значение в выпячивании мембраны и формировании везикул играют белки тетраспанины (CD63, CD9), которые являются специфичными для ВКВ.
Проникновение ВКВ в клетку-мишень зависит от типа клеток и их способности к фагоцитозу. Описано 3 основных механизма взаимодействия везикул с клеткой-мишенью: рецептор-лиганд ассоциированное взаимодействие, прямое внедрение и интернализация.
С помощью ВКВ осуществляются межклеточные взаимодействия практически во всех клетках организма, тем самым происходит регуляция огромного количества физиологических процессов, таких как гемостаз, поддержание артериального давления и др. [2].
В настоящее время появляется все больше исследований, предполагающих непосредственное участие ВКВ в развитии многих заболеваний, включая COVID-19 [3]. Было показано, что при вирусных инфекциях ВКВ могут содержать частицы вирусов, например, вирус гепатита C или ВИЧ [3], а в оболочке определяются рецепторы мембран клеток-хозяев (в частности, MHC, ACE2, CD9, CD63 и многие другие) [34], которые могут способствовать распространению вирусных частиц [3]. Предполагаемая роль везикул в патогенезе различных инфекций подтверждается исследованием, в котором на некоторых типах клеток (HEK293, SH-SY6Y, HeLa, B cells и T lymphocytes) была увеличена экспрессия тетраспанина CD9, участвующего в продукции ВКВ, что привело к ускорению и усилению эффективности трансдукции лентивирусов в клетках-мишенях [35]. После репликации вируса в зараженной клетке синтезированные фрагменты вируса и ACE2-рецепторы с поверхности мембраны клетки-хозяина упаковываются в мультивезикулярные тельца, которые затем распространяются в окружающие клетки и кровь [36]. Некоторые авторы считают этот механизм ключевым в распространении вирусных частиц, а другие уже дали этому феномену название «гипотеза троянской экзосомы» [37].
Предполагается, что у пациентов, зараженных COVID-19, ВКВ могут участвовать в регуляции иммунного ответа как в сторону стимуляции, так и угнетения [3], что может способствовать развитию цитокинового шторма и приводить к утяжелению течения болезни. Одно исследование показывает, что у пациентов с тяжелыми формами заболевания количество ВКВ в плазме крови выше, чем у пациентов с более легким течением [38]. Однако до сих пор нет морфологических исследований, посвященных роли ВКВ в патогенезе COVID-19, так как визуализация везикул затруднительна в связи с их маленьким размером. Учитывая предполагаемое наличие связи между тяжестью состояния пациентов и количеством межклеточных везикул, необходимо более глубокое изучение патогенетической роли ВКВ при COVID-19.
Клиническая картина
COVID-19 вызывает поражение дыхательных путей, легких, диафрагмы, кишечника, печени, сердца, центральной нервной системы и почек [15, 39—41]. Кроме того, отдельные работы показывают тропизм вируса к тестикулярной ткани, что может способствовать фертильной дисфункции [42].
Наиболее частыми симптомами инфекции являются лихорадка, сухой кашель, одышка, слабость, аносмия, утомляемость, тяжесть в грудной клетке. Реже встречаются различные болевые ощущения, боль в горле, диарея, конъюнктивит, головная боль.
У некоторых пациентов клинические симптомы сохраняются спустя длительное время после инфицирования. Данное состояние не имеет четкого определения и в связи с этим его диагностика затруднительна. У самого синдрома есть довольно большое количество синонимов: постковидный синдром, long-term COVID, chronic-COVID, post COVID, long-haul COVID и т.д. Диагностическим критерием на данный момент считается сохранение симптомов более 3 нед (long-COVID) и более 12 нед (chronic COVID). Распространенность такого явления еще не известна, но предварительные исследования Британского отделения Национального центра статистики показали, что примерно у каждого 5-го пациента с положительным тестом на COVID-19 симптомы сохранялись дольше 5 нед, а у каждого 10-го — в течение 12 нед. C. Sudre и соавт. [43] показали, что более 12 нед клиническая картина сохранялась лишь у 2,3% больных, причем самые распространенные симптомы — усталость и преходящие головные боли, потеря запахов и одышка. Патогенез этого синдрома еще не изучен, однако существует несколько теорий. Одной из таковых является прямое цитопатическое действие вируса на органы и ткани, такие как ЦНС. Нейротропность вируса способствует повреждению различных структур нервной системы, в частности, блуждающего нерва, приводя к разбалансировке парасимпатической и симпатической нервной системы с активацией последней. В результате этого развиваются классические симптомы гиперактивности симпатической нервной системы в виде тахикардии, диареи, тревожных расстройств и проблем со сном [44]. Другой теорией является длительная персистенция вируса, еще одна теория говорит об участии в развитии post COVID аутоиммунных расстройств в связи с повреждением эндотелия и формированием антифосфолипидного синдрома. У некоторых пациентов типичные симптомы продолжаются более 100 дней, что снижает качество их жизни.
Несмотря на множество органов-мишеней, вирус SARS-CoV-2 поражает преимущественно респираторную систему, поэтому особое внимание нужно заострить на морфологии повреждения легких при COVID-19.
Поражение легких
На данный момент зарубежными авторами опубликовано большое количество работ, в которых приводятся данные о патогенезе инфекции COVID-19, однако лишь единичные из них описывают подробные морфологические проявления у пациентов с различными формами болезни. Е.А. Коган и соавт. [28] показывают, что при COVID-19 в легких развиваются такие патологические процессы, как диффузное альвеолярное повреждение (ДАП), сопровождающееся васкулитами веточек легочной артерии мелкого и среднего калибра, вирусно-бактериальной пневмонией, распространенной коагулопатией с тромбозами и тромбоэмболией легочной артерии, интерстициальным фиброзом, аденоматозом и дисрегенераторными изменениями легочного эпителия, которые могут быть взаимосвязаны и являться формами-фазами патологии легких при COVID-19 [28].
При ДАП макроскопически легкие плотной консистенции, напоминают ткань печени, мало- или безвоздушные, «лакового» вида, поверхность темно-красного цвета, при надавливании с поверхности разрезов стекает темно-красная жидкость. Легкие, как правило, заполняют весь объем грудной клетки. Если же аутопсия проводится в пролиферативную фазу ДАП, то легкие имеют серовато-белый цвет, очень плотную консистенцию, на разрезе ткань напоминает войлок. При проведении водной пробы фрагмент легкого тонет в воде. При гистологическом исследовании в раннюю экссудативную фазу выявляют внутриальвеолярный отек, гиалиновые мембраны, выстилающие контуры альвеол, которые прорастают фибробластами и коллагеновыми волокнами в пролиферативную фазу. Помимо этого в экссудативную фазу наблюдалось полнокровие капилляров межальвеолярных перегородок, а также ветвей легочных артерий и вен, в большинстве случаев со сладжами эритроцитов, фибриновыми или организующимися тромбами, очагами периваскулярных кровоизлияний.
Развитие ДАП может быть спровоцировано прямым цитопатическим действием вируса на эндотелиоциты с дальнейшим увеличением количества эндотелиальных внеклеточных везикул. При проведении экспериментов было показано, что повышение уровня эндотелиальных везикул в венозной крови приводило к поражению легких в виде повышения проницаемости сосудистой стенки, отека, нейтрофильной инфильтрации альвеол. Возможно, при COVID-19 в связи с распространением вируса количество везикул может увеличиться, что и обусловит развитие ДАП.
Практически у всех пациентов с COVID-19 развивается коагулопатия, сопровождающаяся системным тромбозом, в частности, тромбозом ветвей легочный артерий, что приводит к развитию геморрагических инфарктов легких, имеющих соответствующую морфологическую картину. Макроскопически в висцеральных листках плевры отмечаются мелкие петехиальные кровоизлияния, развивающиеся в рамках ДВС-синдрома.
В стенках и просветах альвеол обнаруживают альвеолоциты с измененной формой клеток (крупные, местами отростчатые клетки), с укрупненными ядрами с грубозернистым хроматином и отчетливыми ядрышками, иногда вокруг ядра присутствовало гало, а в цитоплазме клеток были округлые включения. На отдельных участках могут встречаться многоядерные клетки. Такие изменения следует трактовать как цитопатический эффект, что является косвенным подтверждением вирусного повреждения.
Внутриальвеолярное скопление эритроцитов выявляли практически во всех наблюдениях, однако выраженность его в разных случаях и в различных участках легкого неодинакова — от небольших скоплений до практически полного заполнения просвета альвеол эритроцитами в зонах геморрагических инфарктов. Эти изменения можно расценивать как результат поражения эндотелия с резким повышением сосудистой проницаемости. На отдельных участках в легких как следствие коагулопатии отмечались множественные кровоизлияния с деструкцией ткани легкого. В капиллярах межальвеолярных перегородок нередко встречались мегакариоциты. В просветах альвеол наблюдалось скопление лимфоцитов, плазматических клеток и макрофагов, единичных нейтрофилов, выраженность клеточной реакции была различной. Отмечалась довольно значимая мононуклеарная инфильтрация, представленная различными популяциями лимфоцитов, при этом наибольшее количество CD3+ Т-лимфоцитов, среди которых чаще встречались супрессоры CD2+, CD5+, CD8+. CD20+ B-лимфоциты образовывали небольшие перибронхиальные скопления. CD80+ были сравнительно немногочисленными, натуральные киллеры (CD57+) практически полностью отсутствовали, наблюдались лишь единичные клетки в препарате. В эту же фазу заболевания в просветах альвеол у части умерших обнаружены макрофаги, содержащие в цитоплазме фрагменты клеток.
Значимых поражений трахеи при инфекции SARS-CoV-2 не наблюдается, на аутопсии можно обнаружить лишь серозно-геморрагический трахеит, который может быть расценен как следствие ДВС-синдрома либо как результат длительного механического воздействия при интубации. В случае, когда COVID-19 присоединялся к другой тяжелой патологии, закономерно отмечалось сочетание изменений, характерных для разных заболеваний. При присоединении бактериального компонента к вирусу SARS-CoV-2 макроскопически определялись признаки очаговой пневмонии в виде мелких округлых зернистых очажков, в центре которых расположены мелкие бронхи, заполненные гнойным экссудатом. Микроскопическая картина в данном случае соответствует классическим морфологическим проявлениям бактериальной пневмонии.
В поздних стадиях заболевания у пациентов нередко (25%) развивается интерстициальный фиброз вплоть до образования «сотового легкого». Очаги дисплазии бронхиального и бронхиолярного эпителия с плоскоклеточной метаплазией встречались в 32% наблюдений [28].
Заключение
COVID-19 — быстро распространяющееся инфекционное заболевание, которое сильно влияет на здоровье всего населения и экономическое благополучие всех стран. В патогенезе коронавирусной инфекции принимают участие внеклеточные везикулы, подробное изучение которых позволит не только патогенетически воздействовать на данного возбудителя, но также использовать имеющиеся знания при исследовании других инфекционных процессов. В дальнейшем необходимо определить специфичность иммуногистохимического исследования с использованием маркеров к мембранным белкам внеклеточных везикул (CD63, CD9, CD81) для того, чтобы внедрить визуализацию везикул в рутинную патолого-анатомическую практику. Определение внеклеточных везикул позволит более точно прогнозировать течение не только инфекционного заболевания, но и опухолевых процессов и аутоиммунных заболеваний у конкретного пациента.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.