Известно, что хронический отек роговицы в большинстве случаев обусловлен повышением проницаемости для внутриглазной жидкости ее эндотелиального слоя, возникающим вследствие необратимого уменьшения количества эндотелиальных клеток (ЭК) и снижения плотности ионных каналов [1]. Наиболее часто встречается эндотелиальная дистрофия (ЭД) Фукса — генетически детерминированное заболевание роговицы, для которого характерна биомикроскопическая картина «cornea guttata»: на задней поверхности роговицы между ЭК определяются каплевидные образования различного размера — гутты, сливающиеся с десцеметовой мембраной (ДМ) и постепенно разрушающие эндотелиальный слой. Вторичная буллезная кератопатия (БК), как правило, вызвана снижением плотности ЭК вследствие их повреждения при экстракции катаракты и других интраокулярных вмешательствах на фоне повышения внутриглазного давления или в условиях локального воспалительного процесса [2].
К современным методам оценки состояния роговицы in vivo, позволяющим выявить ее структурные изменения, относят оптическую когерентную томографию (ОКТ). Данный метод обеспечивает дифференциальную диагностику транзиторного помутнения роговицы, обусловленного разреженностью волокон на фоне выраженного стромального отека и необратимого снижения прозрачности роговицы, связанного с ее фиброзными изменениями [3, 4]. В литературе [5—7] существуют немногочисленные данные о корреляции результатов ОКТ роговицы и морфологического анализа удаленных при кератопластике образцов роговичной ткани пациентов.
Цель исследования — изучить структурные изменения роговицы при эндотелиальной дистрофии Фукса и вторичной буллезной кератопатии на основании данных морфологического и иммуногистохимического анализа, а также оптической когерентной томографии.
Материал и методы
В исследование были включены 86 пациентов (88 глаз). В 1-ю группу вошли 44 пациента (46 глаз) с клиническим диагнозом ЭД Фукса, во 2-ю — 42 пациента (42 глаза) с клиническим диагнозом вторичной БК (см. таблицу). До операции всем больным проводили стандартное офтальмологическое обследование.
ОКТ роговицы. Данный метод визуализации in vivo структурных изменений роговицы был выполнен с использованием оптического когерентного томографа RTvue-100 («Optovue», США). Всем пациентам определяли толщину ДМ в центральной и парацентральных (височной и носовой) зонах. На основании полученных данных вычисляли среднее арифметическое значение толщины ДМ каждого пациента. При отсутствии необратимых стромальных помутнений (по данным биомикроскопии и ОКТ роговицы) пациентам 1-й и 2-й групп выполняли заднюю послойную кератопластику (ЗПК) — замещение ДМ и эндотелия роговицы аналогичной тканью донора. В остальных случаях проводили сквозную кератопластику (СКП), включавшую замену всех слоев роговицы донорской тканью. У всех пациентов во время операции были получены образцы роговичной ткани (при ЗПК — комплекс ДМ и эндотелия (ДМ-Э), при СКП — полнослойная роговица), см. таблицу.
Клиническая характеристика пациентов
| Показатель | ЭД Фукса (1-я группа) | Вторичная БК (2-я группа) |
| Число пациентов (количество глаз) | 44 (46) | 42 (42) |
| Пол, м/ж | 15/29 | 23/19 |
| Возраст, годы (M±SD) | 73,54±9,47 | 71,45±10,22 |
| ЗПК/СКП (количество глаз) | 40/6 | 40/2 |
| Вид материала (ДМ-Э/полнослойная роговица) | 40/6 | 40/2 |
Морфологические методы. Образцы ткани фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина с фосфатным буфером и далее изготавливали парафиновые блоки и срезы, один из которых окрашивали гематоксилином и эозином. Визуализацию осуществляли, используя микроскоп Leica DM-2500 с фотокамерой Leica DFC 295 («Leica Microsystems», Швейцария). Морфометрический анализ структуры ДМ-Э и полнослойных роговиц проводили в программе Leica Application Suite V4.8 («Leica Microsystems», Швейцария). В каждом случае выполняли измерения в 3 зонах с шагом 5 мкм и определяли их среднее арифметическое значение.
Иммуногистохимические (ИГХ) методы. Исследование проводили на депарафинизированных срезах толщиной 3 мкм по стандартным протоколам. Использовали первичные моноклональные антитела к панцитокератину (Cytokeratin AE1/AE3, «Dako Inc.», 1:200), виментину (V9, «Dako Inc.», 1:200) и фибронектину (FN-3, «ThermoFischer Scientific», 1:100). ИГХ-реакцию считали положительной при темно-коричневом окрашивании цитоплазмы клеток (Cytokeratin AE1/AE3 и V9) и ДМ (FN-3).
Статистический анализ данных осуществляли с использованием программы SPSS 26 («IBM»). При нормальном распределении количественные переменные были представлены в виде среднего арифметического (M) и стандартного отклонения (SD), при ненормальном распределении — в виде медианы и квартилей (Me [Q1; Q3]). Значимость различий между двумя независимыми выборками определяли с использованием U-критерия Манна—Уитни. Связь признаков анализировали с применением коэффициента ранговой корреляции Спирмена (rs). Статистически значимыми различия и корреляции считали при p<0,05.
Результаты и обсуждение
ОКТ роговицы
На ОКТ-изображении поперечного среза роговицы ДМ представляла собой внутренний слой роговицы, отличающийся высокой оптической плотностью и состоящий из двух параллельно расположенных линий неодинаковой толщины. При визуальном сравнении поперечных срезов роговиц, независимо от этиологии патологического процесса, толщина передней линии ДМ была меньше, чем задней. В то же время стало очевидным, что вертикальный размер задней линии ДМ при ЭД Фукса был больше, чем при вторичной БК (рис. 1, а, б). При морфометрической оценке у пациентов 1-й группы (ЭД Фукса) толщина всей ДМ составила 23 (19, 27) мкм, а у пациентов 2-й группы (вторичная БК) — 13 (12, 14) мкм (p<0,001). По данным ОКТ у всех больных было отмечено выраженное увеличение вертикального размера стромы роговицы. Неравномерная интенсивность отражения тканью светового сигнала томографа была связана в большинстве случаев с разреженностью гиперрефлективных стромальных волокон, лакунами и вертикальными стриями низкой оптической плотности (см. рис. 1, а, б). Подобные изменения соответствовали диффузному снижению прозрачности роговицы, определяемому при биомикроскопии (с помощью щелевой лампы) и связанному, как правило, с отеком стромы. У 6 пациентов с ЭД Фукса и у 2 — со вторичной БК на ОКТ-картине поперечного среза роговицы были также выявлены обширные участки стромы высокой оптической плотности, расцененные как зоны ее необратимого помутнения (рис. 1, в). Оценка локализации данных участков методом биомикроскопии была ограничена из-за диффузного снижения прозрачности роговицы. Особенностью всех этих случаев было отсутствие визуализации боуменовой мембраны (см. рис. 1, в). У остальных пациентов она была отмечена как тонкая линейная зона относительно высокой оптической плотности, прилегающая к передней поверхности стромы (см. рис. 1, а, б). На ОКТ-изображениях роговиц пациентов обеих групп были установлены патологические изменения эпителиального слоя: участки его выраженного утолщения и истончения (вплоть до полного отсутствия), микрокисты и буллы (см. рис. 1, а—в).
Рис. 1. Оптическая когерентная томограмма роговицы.
а — эндотелиальная дистрофия Фукса (отек стромы); б — вторичная буллезная кератопатия (отек стромы); в — эндотелиальная дистрофия Фукса (фиброз стромы). Десцеметова мембрана — красная стрелка, строма — красная звездочка, боуменова мембрана — зеленая стрелка, эпителий — желтая стрелка.
Гистологические методы
Окрашивание гематоксилином и эозином парафиновых срезов ДМ-Э и полнослойных роговиц всех пациентов показало единичные ЭК на поверхности ДМ (рис. 2, а). Отмечены дистрофические изменения ЭК: ядра вытянутой гантелевидной формы и неоднородная цитоплазма с мелкими прозрачными каплевидными включениями. Вероятно, наличие единичных ЭК в препаратах было обусловлено их потерей при подготовке парафиновых срезов, что связано с их слабой адгезией к ДМ.
Рис. 2. Роговица при эндотелиальной дистрофии Фукса и вторичной буллезной кератопатии.
а — десцеметова мембрана и эндотелий при ЭД Фукса; б — десцеметова мембрана и эндотелий при вторичной БК; в — полнослойная роговица при ЭД Фукса; г — полнослойная роговица при вторичной БК. Окраска гематоксилином и эозином, а, б — ×200, в, г — ×100.
В образцах ДМ-Э и полнослойных роговиц всех пациентов ДМ имела гладкую стромальную поверхность, представленную зоной плотного экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ). Отличительной особенностью ДМ при ЭД Фукса была неровная эндотелиальная поверхность с каплевидными образованиями (см. рис. 2, а). В некоторых образцах полнослойных роговиц (независимо от заболевания) обнаружены зоны отслойки ДМ от задней поверхности стромы (рис. 2, в).
По данным электронной микроскопии интактных роговиц ДМ состоит из переднего «полосатого» слоя, синтезированного в пренатальном периоде, и более гомогенного заднего «неполосатого» слоя, продуцируемого ЭК в постнатальном периоде. Впервые T. Brockmann и соавт. [8] показали менее интенсивное накопление гематоксилина и эозина пренатальным передним «полосатым» слоем ДМ в образцах интактных роговиц, а также при ЭД Фукса и вторичной БК. Полученные результаты также свидетельствуют о неоднородном окрашивании ДМ во всех случаях (см. рис. 2, а, б).
При морфометрическом анализе парафиновых срезов ДМ-Э и полнослойных роговиц толщина ДМ у пациентов 1-й группы (ЭД Фукса) была равна 17,9 [16,14; 20,0] мкм, у пациентов 2-й группы (вторичная БК) — 11,9 [11,3; 13,0] мкм (p<0,001). Сравнительное исследование не выявило статистически значимых различий между толщиной пренатального слоя в обеих группах. В то же время морфометрический анализ показал достоверное увеличение совокупности синтезированных в постнатальном периоде участков ДМ при ЭД Фукса (15,0 [13,4; 17,0] мкм) по сравнению со вторичной БК (9,0 [8,2, 10,0] мкм). В обеих группах была выявлена достоверная прямая корреляционная связь между результатами морфометрического анализа ДМ при ОКТ (in vivo) и при световой микроскопии парафиновых срезов образцов ДМ-Э и полнослойных роговиц (rs1-я группа=0,558 (p<0,001); rs2-я группа=0,793 (p<0,001)). Вероятно, уменьшение толщины ДМ во всех образцах при ЭД Фукса и вторичной БК обусловлено ретракцией материала при фиксации в формалине во время подготовки парафиновых срезов.
Структурный анализ стромы с окрашиванием гематоксилином и эозином был проведен только на парафиновых срезах полнослойных роговиц пациентов с ЭД Фукса и вторичной БК (см. таблицу). Во всех случаях в задних отделах стромы (прилегающих к ДМ) было отмечено плотное расположение коллагеновых волокон ЭЦМ со слабовыраженной клеточной инфильтрацией и участками ангиогенеза в виде тонкостенных новообразованных сосудов (см. рис. 2, в, г). В некоторых образцах подобные патологические изменения стромы распространялись в направлении к боуменовой мембране. Однако в большинстве случаев ЭЦМ стромы средних отделов состоял из рыхло расположенных коллагеновых волокон и новообразованных тонкостенных сосудов, а также был инфильтрирован большим количеством макрофагов, лимфоцитов и кератоцитов. Передние отделы стромы состояли из рыхлого ЭЦМ с небольшим количеством клеток и единичными кровеносными сосудами (см. рис. 2, в, г).
Боуменова мембрана была расположена между стромой и эпителиальным слоем. Во всех образцах полнослойных роговиц обнаружены участки ее патологической деформации и неполного прилегания к передней поверхности стромы (см. рис. 2, в, г).
Окрашивание гематоксилином и эозином показало выраженные структурные изменения многослойного эпителия при ЭД Фукса и вторичной БК. Световая микроскопия выявила как зоны патологического утолщения эпителиального слоя, так и участки практически полного отсутствия клеток на базальной мембране. Во всех случаях было обнаружено увеличение размера ядер и цитоплазмы эпителиоцитов с развитием гидропической дистрофии. Деструкция клеток сопровождалась формированием большого количества тонкостенных интраэпителиальных кист. Помимо этого, были отмечены признаки локального акантоза базального слоя эпителия (см. рис. 2, в, г).
ИГХ методы
При ЭД Фукса и вторичной БК панцитокератин AE1/AE3 (маркер эпителиальных клеток) обнаруживали в виде коричневого окрашивания цитоплазмы ЭК. Однако в связи с неоднородным количеством ЭК в исследуемых образцах сравнительный анализ содержания данного белка в группах не проводили. Как при ЭД Фукса, так и при вторичной БК была отмечена выраженная экспрессия панцитокератина AE1/AE3 в виде коричневого окрашивания цитоплазмы эпителиальных клеток (рис. 3, а).
Рис. 3. Результаты иммуногистохимического исследования роговицы при эндотелиальной дистрофии Фукса и вторичной буллезной кератопатии.
а — экспрессия панцитокератина в эпителиальных клетках при ЭД Фукса; б — экспрессия виментина в эндотелиальных клетках при ЭД Фукса; в — экспрессия виментина в клетках стромы и базальном слое эпителия при вторичной БК; г — экспрессия фибронектина в десцеметовой мембране при ЭД Фукса. Иммунопероксидазная реакция, а, в — ×200, б, г — ×400.
В некоторых образцах ДМ-Э и полнослойных роговиц, относящихся к 1-й группе (ЭД Фукса), была выявлена умеренная экспрессия виментина — маркера клеток мезенхимального происхождения, проявляющаяся при световой микроскопии окрашиванием цитоплазмы ЭК в коричневый цвет (рис. 3, б). Вместе с тем ни в одном случае во 2-й группе (вторичная БК) накопления данного маркера ЭК не установлено. Во всех образцах полнослойных роговиц, включенных в исследование, отмечен высокий уровень экспрессии виментина в клетках стромы, а именно в цитоплазме кератоцитов, лимфоцитов, макрофагов и эндотелия новообразованных сосудов. Кроме того, обнаружена умеренная экспрессия виментина в базальных клетках эпителия роговицы в обеих группах (рис. 3, в).
По данным ИГХ-анализа во всех образцах ДМ-Э и полнослойных роговиц отмечено слабовыраженное неравномерное распределение фибронектина в ДМ. Данный маркер определяли на эндотелиальной и стромальной поверхностях ДМ, а также на границе между ее пренатальным и постнатальными слоями (рис. 3, г). Кроме того, выявлены участки экспрессии фибронектина в виде коричневого окрашивания ЭЦМ стромы, непосредственно под боуменовой мембраной.
Обсуждение
Результаты гистологического исследования образцов ДМ-Э и полнослойных роговиц подтверждают, что хронический отек и помутнение роговицы при ЭД Фукса и вторичной БК обусловлены выраженными дистрофическими изменениями ЭК. Как известно, эндотелий представляет собой монослой высокодифференцированных гексагональных клеток, цикл митотического деления которых остановлен в G1-фазе [9]. В некоторых публикациях используют термин «задний эпителий роговицы» для характеристики фенотипической принадлежности этих клеток [10]. Во всех образцах ДМ-Э и полнослойных роговиц при вторичной БК отмечено окрашивание ЭК панцитокератином — цитогенетическим маркером эпителиальных клеток. Вместе с тем при ЭД Фукса в ЭК выявлена экспрессия виментина, что свидетельствует о процессе постепенного перехода фенотипа ЭК в фибробластоподобный, т.е. об их эпителиально-мезенхимальной трансформации. Ранее в экспериментально-клинических исследованиях показано, что подобное изменение морфологического типа и функционального статуса ЭК при ЭД Фукса приводит к синтезу ими избыточного количества компонентов ЭЦМ, которые накапливаются на эндотелиальной поверхности ДМ в виде гутт [8, 11—13]. Результаты проведенного морфометрического анализа парафиновых срезов ДМ-Э и полнослойных роговиц согласуются с ранее полученными данными и подтверждают, что при ЭД Фукса, в отличие от вторичной БК, происходит утолщение ДМ (преимущественно за счет синтезированных в постнатальном периоде слоев), а эндотелиальная поверхность приобретает волнистую форму из-за каплевидных образований ЭЦМ — гутт.
Несмотря на представленные морфологические и ИГХ-отличия эндотелиального слоя и ДМ при ЭД Фукса и вторичной БК, проведение дифференциальной диагностики этих заболеваний in vivo часто затруднено из-за выраженного снижения прозрачности роговицы и отсутствия полноценной визуализации ЭК и ДМ при биомикроскопии, сканирующей конфокальной микроскопии и зеркальной эндотелиальной микроскопии. В связи с этим целесообразно применение метода ОКТ, основанного на интерферометрическом анализе оптических свойств неоднородных сред с использованием низкокогерентного излучения инфракрасного диапазона [3].
В 2009 г. B. Kaluzny и соавт. [14] впервые in vivo выполнили морфометрический анализ ДМ при ЭД Фукса (3 клинических случая). По данным ОКТ у всех пациентов были выявлены утолщение ДМ, а также ее неровная эндотелиальная поверхность с образованиями каплевидной формы. Впоследствии был проведен сравнительный анализ состояния ДМ у пациентов с ЭД Фукса и без офтальмопатологии [6].
Результаты проведенного морфометрического исследования ДМ при ЭД Фукса согласуются с данными указанных авторов [6, 14]. Параметры ДМ, характерные для вторичной БК, соответствуют представленному M. Shousha и соавт. [6] описанию интактной ДМ у пациентов без офтальмопатологии. Достоверность полученных результатов морфометрического анализа ДМ при ОКТ во всех случаях подтверждена прямой корреляционной связью с данными световой микроскопии парафиновых срезов образцов ДМ-Э и полнослойных роговиц.
У всех пациентов ОКТ показала увеличение размера поперечного среза стромы и неравномерную интенсивность отражения тканью низкокогерентного излучения прибора. Гистологическое исследование парафиновых срезов полнослойных роговиц установило, что в обеих группах участки ЭЦМ, состоящие из рыхло расположенных волокон, соответствовали этим зонам неравномерной оптической плотности стромы на фоне ее выраженного отека. Кроме того, отмечены такие признаки локального хронического воспаления, как выраженная лимфогистиоцитарная инфильтрация ткани, накопление кератоцитов и образование тонкостенных сосудов. Обширные участки стромы высокой оптической плотности на ОКТ-изображениях роговиц in vivo являлись, по данным морфологического исследования их парафиновых срезов, зонами ремоделирования ЭЦМ с исходом в фиброз. Подобные изменения были ранее описаны при ЭД Фукса и вторичной БК и позволили определить, что длительный воспалительный процесс существенно влияет на прозрачность роговицы [15—19].
По данным ОКТ у всех пациентов, включенных в исследование, отмечены неравномерная толщина эпителиального слоя и многочисленные буллы. Сходная картина, включающая в себя также выраженные дистрофические изменения эпителиальных клеток, была описана при морфологическом исследовании парафиновых срезов полнослойных роговиц и свидетельствовала о развитой стадии ЭД Фукса и вторичной БК. Умеренная экспрессия виментина была обнаружена в базальных клетках, являющихся пулом эпителия роговицы. Вероятно, экспрессия клетками данного маркера обусловлена их незрелым фенотипом перед дифференцировкой. По данным ряда авторов [16, 20, 21], описанные изменения эпителиального слоя характерны для ЭД Фукса и вторичной БК.
Заключение
Результаты проведенного исследования подтверждают, что ЭД Фукса и вторичная БК обусловлены нарушением целостности эндотелиального слоя роговицы. Развитие этих состояний включает различные изменения ЭК и ДМ. На развитых стадиях ЭД Фукса и БК отмечены сходные структурные изменения стромы и эпителия. Гистологическое и ИГХ-исследования подтверждают данные, полученные при ОКТ, что позволяет использовать этот метод не только для диагностики ЭД Фукса и вторичной БК in vivo, но и для определения тактики лечения.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Т.А. Демура, Н.В. Фисенко, Г.А. Осипян
Сбор и обработка материала: Т.А. Демура., Н.В. Фисенко, М.А. Афонина
Статистическая обработка: Н.В. Фисенко
Написание текста: Н.В. Фисенко
Редактирование: Т.А. Демура, Г.А. Осипян
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.