Профилактика и лечение сосудистых тромбозов являются одной из острейших и наиболее значимых проблем современной медицины. Примерно у 20% пациентов, перенесших тромбоз, в течение 3 мес развивается рецидив заболевания [1]. Реваскуляризация пораженных вследствие сосудистого тромбоза тканей проходит двумя основными путями: развитием коллатерального кровотока и реканализацией самого тромба. Оба этих процесса в случае поражения магистральных сосудов, протекают длительно, и этого времени может оказаться достаточно для развития некроза тканей и даже органов и конечностей.

Показано, что костномозговые клетки-предшественники (плюрипотентные и конкретные линии стволовых клеток) участвуют в естественном разрешении тромбоза [2-7]. Реваскуляризация тромба, быстрая реканализация вены и восстановление кровообращения в ишемизированных в результате тромбоза тканях были достигнуты в экспериментальных моделях с проангиогенными агентами [3, 7-11].

В литературе имеются только косвенные данные о возможности применения стволовых клеток для реканализации тромба или ускоренного роста коллатералей в ишемизированных тканях, но отсутствуют исследования, доказывающие рост сосудов в регионе, где развился тромбоз, после введения мультипотентных стволовых клеток.

В связи с вышеизложенным проведено исследование возможности применения аутологичных мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток костномозгового происхождения (АМСККП) для восстановления нарушенного кровообращения в тканях в эксперименте на лабораторных животных.

В качестве модели были использованы самцы крыс линии Wag массой 180-200 г в возрасте 6 мес. Все исследования проводили с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», все манипуляции осуществляли под общим ингаляционным эфирным наркозом.

АМСККП второго пассажа, полученные от крысы указанной линии, трансфицировали ДНК плазмиды pЕGFP-N1 («Clontech Laboratories Inc.», США), содержащей ген зеленого флюоресцентного белка GFP под контролем промотора цитомегаловируса и ген устойчивости к неомицину под контролем промотора вируса SV40, необходимого для последующей селекции с использованием дженетицина G418 (pEGFP-N1). Трансфекцию проводили в присутствии реагента для трансфекции TurboFect («Fermentas Life Sciences, Inc.», Канада), согласно рекомендациям производителя, применяли протокол для трансфекции суспензионных клеток. Трансфекцию проводили, используя 1·106 клеток в 1 мл суспензии, 4 мкг ДНК плазмиды и 10 мкл реагента для трансфекции (TurboFect).

Через 4 ч после трансфекции клетки разводили нетрансфицированными клетками в соотношении 1:2,5 соответственно и использовали для введения экспериментальным животным. Оставшиеся после трансплантации клетки поддерживали в культуре в течение 1 мес для оценки эффективности трансфекции и стабильности экспрессии введенного гена.

Экспрессию введенного гена GFP АМСККП крысы оценивали визуально под флюоресцентным микроскопом, непосредственно просматривая культуру или используя камеру Горяева для подсчета трансфицированных клеток через 48 ч после трансфекции. Эффективность трансфекции оценивали как процент светящихся клеток относительно всех клеток в камере Горяева. Процент трансфицированных клеток в разбавленной культуре составлял около 3.

Как и в большинстве случаев при использовании технологии, основанной на введении плазмидной ДНК, наблюдали только временную экспрессию введенного гена зеленого флюоресцентного белка в АМСККП крысы. Культивирование клеток, трансфицированных плазмидой pЕGFP-N1 без селекции (не использовали дженетицин (G418, «Sigma», США), показало снижение количества клеток, синтезирующих зеленый флюоресцентный белок, вследствие их вытеснения нетрансфицированными клетками. Но даже спустя 1 нед в культуре трансфицированных клеток первого пассажа, высеянных из плотности 5000 клеток на 1 см², наблюдали клетки, синтезирующие зеленый флюоресцентный белок.

В доступной литературе описано множество экспериментальных моделей венозного тромбоза. Однако самым простым, самым воспроизводимым и наименее травматичным является метод S. Wessler и соавт. [12]: сочетание венозного застоя (например, лигирование вены) и гиперкоагуляции за счет введения активированного фактора свертывания (например, тромбина).

В асептических условиях скальпелем делали разрез кожи длиной до 3 см на внутренней стороне бедра от паховой складки крысы. Тупым способом выделяли сосудистый пучок и накладывали лигатуру на v. femoralis, как можно ближе к месту впадения в v. circumflexa ilium profunda. В нижнюю треть v. femoralis вводили раствор тромбина (0,5 Ед/мл) до заполнения всего участка от места инъекции до места лигирования (0,03-0,05 мл). Место инъекции пережимали на 3 мин (до формирования тромба) для исключения ретроградного распространения и элиминации введенного препарата через инъекционное отверстие. Через 1 сут осуществляли повторный доступ к тромбированной вене и после удаления лигатуры 50 мкл суспензии АМСККП в культуральной среде (1·10⁶ клеток в 1 мл) вводили непосредственно в вену с тромбом. В качестве контроля использовали интактных крыс, животных с венозным тромбозом без использования АМСККП и с внутривенным применением АМСККП без предварительного тромбоза. Животных выводили из эксперимента передозировкой эфирного наркоза через 4 сут, 1, 2, 3, 4 и 5 нед после введения АМСККП. В каждой группе было 11-12 животных.

V. femoralis с окружающими тканями фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) в течение не менее 24 ч, обезвоживали в градиенте этанола возрастающей концентрации, осветляли в ксилоле и заключали в парафин. Неокрашенные срезы толщиной 5-7 мкм изучали на световом микроскопе Axioimager M1 при увеличении до 1500 в режиме люминесценции с фильтром Alexa 488. Параллельно в режиме проходящего света видимого диапазона изучали срезы, окрашенные гематоксилином и эозином.

При исследовании методом люминесцентной микроскопии у интактных крыс с тромбозом без последующего введения АМСККП и после внутривенной инъекции АМСККП без предварительного моделирования тромбоза во все сроки наблюдения специфическое свечение отсутствовало в стенке магистральных сосудов и в паравазальной клетчатке (рис. 1, а),

Через 4 сут после введения АМСККП в тромбированную вену непосредственно в самой вене сохранялись только остатки тромба, бо`льшая часть просвета такого сосуда была свободна (рис. 2, а, б).

Специфического свечения не было найдено как в самом тромбе, так и в стенке этой вены и в непосредственной близости от сосуда. Вместе с этим крайне редко в послеоперационных грануляциях присутствовали небольшие группы сосудов капиллярного типа, стенки которых состояли из клеток со светящейся цитоплазмой и темным ядром (см. рис. 1, в).

Необходимо обратить внимание еще на один результат. Моделирование тромбоза осуществляли лигированием сосуда на одни сутки и введением тромбина непосредственно после перевязки. Кроме тромбоза одного заинтересованного крупного сосуда, где, кстати, тромб уже почти был лизирован (см. рис. 2, а, б), произошло формирование тромбов в мелких ветвях этого сосуда, проходящих в толще мышц бедра. Проходимость таких мелких сосудов к моменту исследования еще не была восстановлена. В их просвете, в паравазальной клетчатке и в тканях между сосудами были найдены единичные, небольшие, часто овальные специфически светящиеся объекты (см. рис. 1, г), возможно, сосуды, прорастающие через тромб в просвете сосуда (реканализация тромба), и сосуды, формирующиеся рядом с тромбированными для осуществления коллатерального кровотока.

Через 1 нед после инъекции АМСККП в вену с тромбом сосуды и их группы со специфическим свечением в непосредственной близости от тромбированной вены найдены не были. Также отсутствовали светящиеся структуры в стенке и внутри пораженного сосуда: следует отметить наличие фрагментов пристеночного тромба в вене, но специфического свечения в нем не было обнаружено.

Также как и через 4 сут иногда отмечалось специфическое свечение стенок в мелких сосудах, проходящих между мышечными волокнами, однако признаков тромбоза в таких сосудах отмечено не было (см. рис. 1, д, е).

Необходимо обратить внимание, что в межфасцикулярных пространствах поперечнополосатой мышечной ткани, где проходят сосудисто-нервные пучки, присутствует множество кровеносных сосудов с облитерированным просветом, причем облитерация часто была полной (см. рис. 2, в). Тип таким образом измененных сосудов определить было невозможно. Клетки в тканях на месте этих сосудов имели признаки деструктивных изменений (кариопикноз и кариорексис) (см. рис. 2, в). Также в мышечной ткани были найдены варикозно-измененные сосуды (см.рис. 1, е; 2, г).

Через 2 нед после введения АМСККП в вену с тромбом в большинстве наблюдений сосуды и их группы со специфическим свечением в непосредственной близости от тромбированной вены найдены не были. Также отсутствовали светящиеся структуры в стенке и внутри пораженного сосуда.

Следует подчеркнуть, что в единичных наблюденях в области сосудистого пучка или места хирургического вмешательства отмечались сосуды с очень яркими светящимися структурами (см. рис. 1, ж). Эти сосуды были расположены поодиночке, по два или небольшими группами (см. рис. 1, ж). Часто в таких светящихся объектах в сосудистой стенке четко видно темное ядро и ярко светящаяся цитоплазма (см. рис. 1, ж).

Так же как и в предыдущий срок, в массиве мышц бедра были найдены сосуды венозного типа с ярким свечением в стенке. Следует отметить, что число таких сосудов со специфическим свечением значительно возросло, они встречались практически у каждого животного, и неоднократно (см. рис. 1, з). Можно отметить цепочки из таких светящихся сосудов, по-видимому, обусловленные их варикозной извитостью (см. рис. 1, з).

Иногда в таких мелких сосудах присутствовали остаточные явления тромбоза, и если в ряде случаев свечение в их стенке было гомогенным, то при внимательном изучении видны более темные клеточные ядра и ярко светящаяся цитоплазма клеток, причем не только в эндотелии, но и в других оболочках.

Разумеется, не все сосуды были построены с участием светящихся клеток, во всех наблюдениях большинство сосудов, проходящих в мышцах бедра, свечения в структурах их стенок не имели.

Необходимо обратить внимание, что на этом сроке наблюдения у животных контрольной группы (тромбоз без введения АМСККП) в мышечной ткани присутствовали тромбы в просвете мелких сосудов, стенка которых была склеротически изменена (см. рис. 2, д, е). В одном наблюдении на серийных срезах даже удалось проследить не только тромб в просвете сосуда, «хвост» тромба, но и его «голову», место, где тромб прикреплен к сосудистой стенке (место повреждения эндотелия) (см. рис. 2, д, е). Признаков лизиса или реканализации тромбов в этой группе животных через 1 нед после операции обнаружено не было (см. рис. 2, д, е).

На сроке 3 нед после введения АМСККП в тромбированный сосуд практически во всех наблюдениях специфическое свечение отсутствовало как в стенке пораженной вены и паравазальной клетчатке, так и в сосудах рубца на месте хирургического вмешательства.

Также отсутствовало специфическое свечение в стенке сосудов, расположенных в мышечном массиве бедра. Эти сосуды имели признаки варикозной трансформации (широкий растянутый просвет) и на гистологическом срезе были представлены в виде цепочки (поперечный срез через извитой сосуд). В этих сосудах остаточных признаков тромбоза уже найдено не было.

Однако по-прежнему присутствовали сосуды с облитерированным просветом в прослойках соединительной ткани, но вместе с такими сосудами были расположены и сосуды с сохраненным просветом, возможно, после реканализации тромба или вновь образованные (см. рис. 2, ж).

Спустя 4 и 5 нед после введения АМСККП в вену с тромбом у всех животных специфическое свечение отсутствовало как в стенке пораженной вены и паравазальной клетчатке, так и в сосудах рубца на месте хирургического вмешательства. Расположенные в мышечной ткани бедра сосуды также не содержали в стенке светящихся объектов, но можно отметить утолщенную стенку и складчатость эндотелиальной выстилки некоторых артерий на 4-й неделе после операции (см. рис. 2, з).

В литературе имеется множество данных о том, что введение в поврежденные ткани недифференцированных стволовых клеток сопровождается ангиогенезом. Методами световой микроскопии изучали результаты введения АМСККП в рубцовую ткань крыс и человека. Было выявлено формирование групп кровеносных сосудов после использования АМСККП. Сделано заключение, что после введения в рубец АМСККП они формируют кровеносные сосуды за счет дифференцировки в эндотелиоциты и перициты [13, 17].

Настоящее исследование нами было предпринято в связи с тем, что существует положение о возможности применения клеточных технологий для ускорения разрешения тромбозов [2-7].

Однако, согласно нашим результатам, уже через 4 сут после тромбоза вены, инициированного как без, так и после введения АМСККП, непосредственно в самой вене сохранялись только остатки тромба, бо`льшая часть просвета сосуда была свободна. Таким образом, восстановление кровотока в тромбированной магистральной вене всегда происходило за счет тромболизиса, приводящего уже к 4-м суткам к рассасыванию большей части тромботических масс. Тромболизис осуществляется за счет гуморальных факторов и не требует привлечения как собственных, так и введенных стволовых клеток. Признаков встраивания АМСККП в стенку сосуда с тромбом не было найдено ни в одном случае на всех сроках эксперимента. Признаков реканализации тромба и формирования коллатералей мы также не обнаружили.

Одновременно в послеоперационных грануляциях присутствовали небольшие группы сосудов капиллярного типа, стенки которых состояли из клеток со светящейся цитоплазмой и темным ядром. Доказательством того, что данные группы сосудов были сформированы именно в результате введения АМСККП и из них, является свечение клеточной цитоплазмы. Ген GFP, введенный в ДНК АМСККП, неизменным передается дочерним клеткам и клеткам следующих поколений. Эти клетки и структуры, сформированные из них, точно также светятся в отраженном ультрафиолетовом свете.

Видимо, АМСККП после попадания в тромбированную вену выходят в ткани через инъекционное отверстие вследствие высокого давления в такой вене, обусловленного самой инъекцией на фоне препятствия кровотоку. Попав в ткани, АМСККП принимают участие в формировании сосудов грануляций.

Формирование тромбов в мелких сосудах, расположенных в мышечной ткани бедра (обнаружено через 4 сут после введения тромбина), вероятно, связано с тем, что после введения тромбина он действует не только в магистральном сосуде, но и распространяется ретроградно (вследствие перевязки магистрали и нарушения оттока) на его ветви, вызывая тромбоз в них. Затем в магистральной вене тромб лизируется, а в мелких сосудах фибрин организуется, постепенно поглощается фагоцитами, что часто приводит к облитерации просвета сосуда. Затем или рядом развиваются новые сосуды, или питание мышечной ткани осуществляется за счет уже имеющихся коллатералей. В пользу поражения мелких сосудов после введения тромбина в магистральную вену также свидетельствует наличие в мышечной ткани варикозно-измененных сосудов. Подобный вид сосуды приобретают при повышении внутрисосудистого давления, например при нарушении оттока вследствие тромбоза.

Учитывая появление в массиве бедренных мышц все большего числа сосудов венозного типа с ярким свечением в стенке к сроку 2 нед после тромбоза и введения АМСККП, можно заключить, что восстановление кровотока в регионе вены с тромбозом, в мелких ее ветвях, видимо, также тромбированных, максимально на данный срок.

К 3-й неделе ангиогенез в поврежденных тканях, по-видимому, был практически закончен, и с этого срока количество объектов со специфическим свечением прогрессивно уменьшалось как в паравазальной клетчатке, так и в сосудах рубца на месте хирургического вмешательства. Расположенные в мышечной ткани бедра сосуды имели широкий просвет, часто были варикозно извиты, но уже не содержали в стенке светящихся объектов.

Скорее всего, введенные АМСККП (клетки и структуры, сформированные из введенных АМСККП), взятые пусть и у генетически идентичной (линейные крысы), но все-таки другой особи, постепенно были вытеснены собственными клетками организма-реципиента [14, 15, 17]. Тем более что введенные АМСККП содержали в геноме чужеродную ДНК, кодирующую синтез GFP.

Присутствие в мышечной ткани сосудов с растянутым просветом и тонкой стенкой, а также варикозно-измененных через 3 нед после операции может указывать на блокаду кровотока выше уровня гистологического среза - в месте впадения этого сосуда в ранее тромбированную магистральную вену. Кроме того, указанные изменения могут являться свидетельствами повышения интенсивности кровотока для компенсации последствий тромбоза магистральной вены (коллатеральный ток).

О повышении давления в сосудах в прошлом, видимо, свидетельствует и складчатость эндотелиальной выстилки некоторых артерий, отмеченная через 4 нед после хирургического вмешательства. Не исключено, что подобные изменения связаны с предшествующим венозным тромбозом. Когда венозная часть сосудистого русла окклюзирована, в артериях повышается давление, и их просвет расширяется. При нормализации условий гемодинамики просвет артерий возвращается к исходным показателям, но, видимо, какое-то время еще сохраняется гипертрофия оболочек (повышенное давление в прошлом) и складчатость эндотелия (растянутые структуры при нарушении венозного оттока).

На основании полученных результатов можно заключить, что восстановление кровотока в тромбированной магистральной вене всегда идет путем тромболизиса. Признаки встраивания введенных АМСККП в стенку тромбированного сосуда не найдены. Реканализация тромба и формирование коллатералей также не обнаружены. При моделировании тромбоза в эксперименте введением тромбина и лигированием магистральной вены также отмечается формирование тромбов в ее мелких ветвях, восстановление кровотока в которых происходит или через реканализацию тромба, или через облитерацию тромбированных сосудов и прорастание новых. АМСККП участвуют в обоих этих процессах, что приводит к более быстрому восстановлению кровотока в бассейне пораженной вены. Постепенно введенные АМСККП и структуры, сформированные с их участием, вытесняются собственными клетками организма-реципиента.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы «Исследование генных и клеточных подходов в терапии заболеваний сердечно-сосудистой системы или опорно-двигательного аппарата» (ГК16.512.11.2099 «Исследование возможности использования генных и клеточных подходов в диагностике, профилактике и лечении тромбоэмболических осложнений сердечно-сосудистых заболеваний для снижения уровня смертности и ранней инвалидизации трудоспособного населения РФ»).

Конфликт интересов: авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.

Участие авторов: 

Концепция и дизайн исследования - И.М., В.М., Я.Н., В.М.

Сбор и обработка материала - И.М., В.М., Я.Н., В.М., Л.А., А.М., С.Х., С.М.

Статистическая обработка - –

Написание текста - И.М., В.М., Я.Н., В.М.

Редактирование - И.М., В.М., Я.Н.