Введение
Болезни сердечно-сосудистой системы являются одной из ведущих причин смертности населения. Среди них на атеросклероз приходится 28,6% смертности у женщин и 26,5% у мужчин. В основную группу риска, как правило, входят женщины в возрасте от 70 лет и мужчины старше 60 лет [1]. Среди всех сердечно-сосудистых заболеваний лидирующую позицию занимает ишемическая болезнь сердца (ИБС) и лежащий в ее основе атеросклероз коронарных артерий [2].
Изучение причин атеросклероза на сегодняшний день — одно из наиболее распространенных направлений научных исследований по всему миру. Известно, что атеросклеротическое повреждение имеет многофакторную природу и сопровождается каскадом процессов, контроль за которыми осуществляется на генетическом уровне. Согласно современным представлениям о причинах развития атеросклероза, принято выделять три основные теории: эндотелиальная дисфункция, нарушения липидного обмена и теория воспаления [3].
Известно, что повреждение эндотелиального слоя сопровождается активной экспрессией различного рода молекул [4]. К таким молекулам относятся Е- и P-селектины, VCAM, ICAM и другие. Помимо общепринятых факторов риска развития атеросклероза на настоящий момент большое внимание уделяется генетическому компоненту. Накопленные литературные данные свидетельствуют о значительной роли селектинов в атерогенезе [4—7]. Помимо селектинов в атерогенезе также участвует эндотелиальная NO-синтаза, катализирующая реакцию образования окиси азота (NO) из L-аргинина, играющая важную роль в регуляции тонуса кровеносных сосудов, работы гладкомышечной мускулатуры сосудистой стенки, процессе тромбообразования и атерогенеза и кодирующаяся геном NOS3. Четко прослеживается связь между уровнем NO в организме и выраженностью окислительного стресса при сосудистой патологии [8]. Кроме того, недавно была показана роль сосудосуживающего пептида эндотелина (кодируемого геном EDN1), играющего ключевую роль в гомеостазе кровеносных сосудов, в патогенезе ИБС [9].
На основании вышеизложенного можно предположить, что изменчивость структуры генных локусов, кодирующих белки молекул клеточной адгезии, NO-синтазы и эндотелина, может оказывать влияние на активацию эндотелия, выраженность воспалительного ответа в эндотелии сосудов и увеличивать риски развития и скорости прогрессирования атеросклероза и ИБС.
Таким образом, целью данной работы явилось изучение влияния генетического полиморфизма в генах клеточной адгезии SELE, SELP и SELPLG, гене эндотелина EDN1 и эндотелиальной синтазы оксида азота NOS3 на риск развития стабильной ИБС.
Материал и методы
Проведенное исследование выполнено на базе ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» (г. Кемерово) и одобрено локальным этическим комитетом. В исследование включены 560 пациентов, из них 260 больных со стабильной ИБС и 300 условно здоровых доноров. Средний возраст больных в группе исследования составил 58 лет, в группе контроля — 53 года.
У всех участников исследования проводили забор венозной крови из локтевой вены в пробирку с К3ЭДТА для дальнейшего выделения геномной ДНК методом фенол-хлороформной экстракции. Помимо этого также проводили сбор крови в пробирку с активатором свертывания для определения сывороточных белков методом твердофазного иммуноферментного анализа. Все полученные образцы были промаркированы и сохранены при низкой температуре до момента исследования.
Для исследования выбраны 8 полиморфных вариантов пяти генов: SELE (rs5361, rs1805193), SELP (rs6136), SELPLG (rs2228315), EDN1 (rs3087459, rs5370), NOS3 (rs2070744, rs1799989). Их характеристики представлены в табл. 1.
Таблица 1. Характеристика генов, включенных в исследование
| SNP | Нуклеотидная замена | Хромосомная позиция | Функциональное значение |
| SELE | |||
| rs5361 | T>G | 1:169731919 | Missense Variant |
| rs1805193 | C>A | 1:169733631 | 5 Prime UTR Variant |
| SELP | |||
| rs6136 | T>G | 1:169594713 | Missense Variant |
| SELPLG | |||
| rs2228315 | C>T | 12:108624122 | Missense Variant |
| EDN1 | |||
| rs3087459 | A>C | 6:12289406 | Intron Variant |
| rs5370 | G>T | 6:12296022 | Missense Variant |
| NOS3 | |||
| rs2070744 | C>T | 7:150992991 | Intron Variant |
| rs1799983 | G>T | 7:150999023 | Missense Variant |
Генотипирование проводили методом полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени по технологии TaqMan с использованием прибора ViiA 7 (LifeTechnologies, США). Для оценки контроля качества проведенного молекулярно-генетического анализа были отобраны контрольные образцы с известными генотипами, 10% образцов генотипировали повторно.
Количественное содержание в сыворотке крови определяли при помощи коммерческих наборов sE-selectin (кат. номер BMS205), sP-selectin (кат. номер BMS219-4), Endothelin (кат. номер DET100) и eNOS (кат. номер DY950-05) для научных исследований в соответствии с протоколом производителя и с детекцией результатов по оптической плотности на приборе Multiskan Sky Microplate Spectrophotometer (Thermo Scientific, США).
Для статистической обработки полученных результатов использовали программы GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, США) и SNPstats. Проверку на нормальность распределения осуществляли с помощью критерия Колмогорова—Смирнова. Сравнение значений признака в разных группах осуществляли с помощью непараметрических критериев Манна—Уитни и Краскела—Уоллиса. Для оценки различия в частотах качественных и номинальных данных использовали тест χ2 с поправкой Йейтса на непрерывность. Количественные данные представлены в виде медианы (Me), 25-го и 75-го перцентилей. Для оценки риска вычисляли отношение шансов (ОШ) и 95% доверительный интервал. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты
Анализ ассоциаций генотипов с предрасположенностью к развитию стабильной ИБС
Распределение частот генотипов исследуемых полиморфных вариантов соответствовало равновесию Харди—Вайнберга. Сравнительный анализ встречаемости генотипов и их ассоциации с предрасположенностью к развитию ИБС показал несколько статистически значимых различий. Так, показано, что гетерозиготный генотип C/A полиморфного варианта rs1805193 гена SELE, кодирующий молекулу Е-селектина, встречался чаще в группе контроля по сравнению с группой исследования и обладал протективным эффектом (ОШ 0,56; 95% ДИ 0,34—0,91) в отношении развития ИБС. Кроме этого, получены две ассоциации, увеличивающие риск развития ИБС. Одна из них получена для гетерозиготного генотипа G/T полиморфизма rs5370 EDN1 (ОШ 1,90; 95% ДИ 1,24—2,91), который повышает предрасположенность к развитию ИБС практически в два раза. Еще одна взаимосвязь получена для гена NOS3 и его полиморфного варианта rs1799983. Для данного варианта установлено, что гомозиготный генотип T/T встречался в группе исследования практически в два раза чаще, увеличивая риск ИБС в 4 раза (ОШ 4,00; 95% ДИ 2,10—7,62). С другими полиморфными вариантами статистически значимых различий не было получено (табл. 2).
Таблица 2. Частота встречаемости генотипов исследуемых полиморфных вариантов
| Ген | Пациенты с ИБС | Контрольная группа | ОШ (95% ДИ) | p-критерий | HWE |
| SELE rs5361 | |||||
| T/T | 226 (87,3%) | 248 (82,7%) | 1,00 | 0,3 | 0,19 |
| G/T | 31 (12%) | 48 (16%) | 0,71 (0,44—1,15) | ||
| G/G | 2 (0,8%) | 4 (1,3%) | 0,55 (0,10—3,02) | ||
| SELE rs1805193 | |||||
| C/C | 228 (88%) | 242 (80,7%) | 1,00 | 0,019 | 0,56 |
| C/A | 29 (11,2%) | 55 (18,3%) | 0,56 (0,34—0,91)* | ||
| A/A | 2 (0,8%) | 3 (1%) | 0,71 (0,12—4,27) | ||
| SELP rs6136 | |||||
| T/T | 207 (79,9%) | 235 (78,3%) | 1,00 | 0,9 | 0,95 |
| G/T | 49 (18,9%) | 61 (20,3%) | 0,91 (0,60—1,39) | ||
| G/G | 3 (1,2%) | 4 (1,3%) | 0,85 (0,19—3,85) | ||
| SELPLG rs2228315 | |||||
| C/C | 230 (88,8%) | 268 (89,3%) | 1,00 | 0,98 | 0,10 |
| C/T | 27 (10,4%) | 30 (10%) | 1,05 (0,61—1,82) | ||
| T/T | 2 (0,8%) | 2 (0,7%) | 1,17 (0,16—8,34) | ||
| EDN1 rs3087459 | |||||
| A/A | 171 (66%) | 220 (73,3%) | 1,00 | 0,15 | 0,80 |
| A/C | 80 (30,9%) | 74 (24,7%) | 1,47 (0,96—2,25) | ||
| C/C | 8 (3,1%) | 6 (2%) | 1,75 (0,52—5,86) | ||
| EDN rs5370 | |||||
| G/G | 153 (59,1%) | 221 (73,7%) | 1,00 | 0,011 | 0,21 |
| G/T | 95 (36,7%) | 66 (22%) | 1,90 (1,24—2,91)* | ||
| T/T | 11 (4,2%) | 13 (4,3%) | 1,19 (0,47—2,98) | ||
| NOS3 rs2070744 | |||||
| T/T | 111 (42,9%) | 107 (35,7%) | 1,00 | 0,067 | 0,17 |
| C/T | 101 (39%) | 149 (49,7%) | 0,71 (0,47—1,08) | ||
| C/C | 47 (18,1%) | 44 (14,7%) | 1,30 (0,74—2,28) | ||
| NOS3 rs1799983 | |||||
| G/G | 99 (38,2%) | 174 (58%) | 1,00 | 0,0001 | 0,01 |
| G/T | 112 (43,2%) | 106 (35,3%) | 1,97 (1,30—2,98)* | ||
| T/T | 48 (18,5%) | 20 (6,7%) | 4,00 (2,10—7,62)* | ||
Примечание. * — достоверные различия по сравнению с контролем (p<0,05).
Кроме проведенного анализа по сравнению отдельных генотипов с предрасположенностью к развитию ИБС мы оценили вклад гаплотипов генов SELE, SELP и SELPLG и их взаимосвязь с риском развития ИБС (табл. 3). Анализ ассоциаций гаплотипов полиморфных вариантов генов SELE, SELP и SELPLG не показал статистически значимых различий.
Таблица 3. Анализ ассоциаций гаплотипов полиморфных вариантов генов SELE, SELP и SELPLG и риска развития ИБС
| № п/п | rs5361 | rs1805193 | rs6136 | rs2228315 | Частота встречаемости, % | ОШ (95% ДИ) | p-критерий |
| 1 | T | C | T | C | 0,77 | 1,00 | — |
| 2 | T | C | G | C | 0,09 | 0,85 (0,55—1,30) | 0,45 |
| 3 | G | A | T | C | 0,06 | 0,69 (0,41—1,18) | 0,18 |
| 4 | T | C | T | T | 0,04 | 0,99 (0,50—1,94) | 0,97 |
| 5 | T | C | G | T | 0,01 | 1,53 (0,38—6,12) | 0,54 |
Примечание. * — достоверные различия по сравнению с контролем (p<0,05).
Результаты, полученные при сравнении гаплотипов полиморфных вариантов генов EDN и NOS3, позволили выявить один гаплотип — AGCT (rs3087459-rs5370-rs2070744-rs1799983), увеличивающий предрасположенность к ИБС в 2 раза (ОШ 2,09; 95% ДИ 1,21—3,62) (табл. 4).
Таблица 4. Анализ ассоциаций гаплотипов полиморфных вариантов генов EDN и NOS3 и риска развития ИБС
| № п/п | rs3087459 | rs5370 | rs2070744 | rs1799983 | Частота встречаемости, % | ОШ (95% ДИ) | p-критерий |
| 1 | A | G | T | G | 0,35 | 1,00 | — |
| 2 | A | G | C | G | 0,19 | 0,38 (0,22—0,65) | 0,001* |
| 3 | A | G | T | T | 0,13 | 0,89 (0,51—1,55) | 0,69 |
| 4 | A | G | C | T | 0,11 | 2,09 (1,21—3,62) | 0,01* |
| 5 | C | T | T | G | 0,06 | 0,82 (0,40—1,67) | 0,58 |
| 6 | C | T | C | T | 0,04 | 2,94 (1,00—8,65) | 0,05 |
| 7 | A | T | T | G | 0,03 | 0,93 (0,36—2,40) | 0,88 |
| 8 | C | T | C | G | 0,02 | 2,55 (0,57—11,29) | 0,22 |
| 9 | C | T | T | T | 0,02 | 2,67 (0,38—18,84) | 0,32 |
| 10 | C | G | T | G | 0,01 | 0,10 (0,00—4,35) | 0,23 |
| 11 | A | T | T | T | 0,01 | 0,55 (0,11—2,73) | 0,46 |
Примечание. * — достоверные различия по сравнению с контролем (p<0,05).
Предполагается, что генетическая составляющая может влиять на сывороточные уровни циркулирующих белков. Для проверки данной гипотезы был проведен сравнительный анализ концентраций растворимых форм E-селектина, P-селектина, эндотелина и эндотелиальной синтазы азота (eNOS) с носительством аллелей исследуемых полиморфных вариантов у пациентов с ИБС (рисунок). Анализ данных показал, что носители гомозиготных генотипов T/T и G/G полиморфного варианта rs6136 SELP имеют более высокие уровни растворимой формы Р-селектина (136,4 [106,8; 184,2] нг/мл) по сравнению с носителями гетерозиготного генотипа G/T (104,8 [77,8—130,9] нг/мл) (p=0,02). Однако с остальными полиморфными вариантами статистически значимых результатов не получено.
Обсуждение
Основными молекулами клеточной адгезии являются P-селектин и Е-селектин, которые непосредственно связаны с процессом воспаления сосудов различной локализации. К поверхностным маркерам относится Е-селектин [4], тогда как P-селектин усиливает прокоагулянтную активность и активацию лейкоцитарных интегринов [10]. Учитывая это, можно сказать, что белки молекул адгезии потенциально являются активаторами атеросклеротического процесса на ранних стадиях.
Сывороточная концентрация изученных молекул в зависимости и носительства конкретных генотипов.
Е-селектин — белок, кодируемый геном SELE, экспрессия которого наблюдается, как правило, в активированных эндотелиальных клетках. Данный белок способствует связыванию и адгезии лейкоцитов на эндотелиальных клетках. E-селектин также участвует в миграции лейкоцитов путем активации внутриклеточных сигнальных путей. Для его экспрессии требуется активация промотора. Трансляция данного белка в эндотелиальных клетках сопровождается его модификацией с добавлением олигосахаридов. Затем E-селектин перемещается непосредственно от комплекса Гольджи к поверхности клетки. Е-селектин удаляется с поверхности эндотелиальных клеток путем эндоцитоза [11]. SELE ассоциирован с такими заболеваниями сердечно-сосудистой системы, как артериальная гипертензия [12], инфаркт миокарда [13], атеросклероз [14].
Белок Р-селектин имеет размер 140 кДа, хранится в α-гранулах тромбоцитов и тельцах Вайбеля—Паладе эндотелиальных клеток. Этот белок перераспределяется на плазматическую мембрану во время активации и дегрануляции тромбоцитов и опосредует взаимодействие активированных эндотелиальных клеток или тромбоцитов с лейкоцитами. Кодируется геном SELP. Последний ассоциирован с такими заболеваниями сердечно-сосудистой системы, как хроническая сердечная недостаточность [15], атеросклероз [16], инфаркт миокарда [17].
Ген SELPLG (лиганд P-селектина) кодирует гликопротеин, который функционирует как контррецептор для молекул клеточной адгезии P, E и L-селектинов, экспрессирующихся на миелоидных клетках и стимулированных Т-лимфоцитах. Данный протеин играет важную роль в воспалении из-за способности связывать лейкоциты с активированными тромбоцитами или эндотелием, экспрессирующим данные селектины.
Значение вариабельности генов молекул клеточной адгезии в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе ИБС, подтверждается в исследованиях, проводимых в разных странах мира. В одном из ранних метаанализов авторы исследовали значение полиморфизма SELE в патогенезе ИБС и инфаркта миокарда. Для исследования использовали следующие базы данных: PubMed, CISCOM, CINAHL, Web of Science, Google Scholar, EBSCO, Cochrane Library и CBM. Авторы систематизировали данные работ, опубликованных до 1 ноября 2013 г. Авторами рассмотрены в общей сложности 20 статей с описанием 6 полиморфных сайтов SELE (554 L/F, 98 G/T, 128 S/R, 2692G/A, 1901 C/T и 1856 A/G). Полученные данные дают основания предполагать, что полиморфизм SELE напрямую связан с повышением риска развития ИБС. При этом связи с риском инфаркта миокарда не подтвердились [18].
В другом анализе литературы авторами рассматривался P-селектин как один из факторов развития сердечно-сосудистых заболеваний, в частности атеросклероза. В ходе анализа было выяснено, что дефицит P-селектина у мышей приводит к задержке рекрутирования нейтрофилов, а введение моноклональных антител к P-селектину уменьшало адгезию лейкоцитов к эндотелиальным клеткам, стимулированным тромбином и гистамином [19].
В исследовании, проведенном на территории Республики Адыгея на малой выборке — из 44 человек (из них 8 пациентов с атеросклерозом коронарных артерий, 9 с атеросклерозом периферических артерий и 10 условно здоровых доноров) без учета этнической принадлежности обследуемых, выполнено генотипирование полиморфных сайтов rs5361 SELE и rs6136 SELP. По итогам исследования установлено, что носительство гомозиготного генотипа и вариантного аллеля rs5361 SELE ассоциировано главным образом с атеросклерозом периферических артерий и в меньшей степени с атеросклерозом коронарных артерий. Носительство минорного аллеля G гена SELP (rs6136) сопряжено с предрасположенностью к атеросклерозу периферических артерий и является молекулярно-генетическим предиктором сосудистых поражений головного мозга — ишемического и геморрагического инсульта. Авторы сделали вывод о наличии связи между отдельными вариациями в полиморфных сайтах с атерогенезом и возможности их использования для донозологической диагностики атеросклероза у жителей Республики Адыгея [20].
В другом исследовании, проведенном на выборке из 208 пациентов и 300 условно здоровых жителей крупного промышленного региона Западной Сибири (Кемеровская область), изучали гены EDN1 (rs3087459, rs5370), SELE (rs1805193, rs5361), SELP (rs6136) и SELPLG (rs2228315). В результате проделанной работы было установлено отсутствие связи между носительством вариантных аллелей в исследуемых полиморфных сайтах и концентрацией соответствующих молекул адгезии в сыворотке крови обследованных лиц [21].
Недавно был проведен анализ ассоциации полиморфизмов гена SELE (G98T rs1805193, A561C rs5361, C1880T rs5355) с атеросклерозом с помощью логистического регрессионного анализа. Было обнаружено, что при кодоминантной, доминантной и аддитивной моделях наследования варианты G98T (rs1805193) и A561C (rs5361) ассоциировались с повышенным риском развития данной патологии. Также продемонстрирована ассоциация генотипа C/T rs5355 с повышенным риском атеросклероза по сравнению с генотипом C/C. Кроме того, гаплотип CT вариантов G98T и A561C был ассоциирован с повышенным риском развития атеросклероза, а гаплотип AG значительно реже встречался у людей с данной патологией [6].
В 2020 г. была также показана связь полиморфизма гена SELP с риском развития атеросклероза и ИБС [22].
Таким образом, имеющиеся данные о роли полиморфизма генов клеточной адгезии SELE, SELP и SELPLG, гена эндотелина EDN1 и эндотелиальной синтазы оксида азота NOS3 в формировании повышенного индивидуального риска развития ИБС достаточно противоречивы и варьируют в зависимости от исследуемой популяции, что обуславливает необходимость дополнительных исследований.
Заключение
В результате проведенного исследования установлены протективные (генотип C/A гена SELE rs1805193) и рисковые (генотип G/T гена EDN1 rs5370 и генотип T/T гена NOS3 rs1799983) варианты в отношении развития ИБС. Кроме того, был обнаружен гаплотип AGCT генов EDN1 и NOS3 (rs3087459-rs5370-rs2070744-rs1799983), ассоциированный с двукратным увеличением риска развития данной патологии. Установлено, что носители генотипов T/T и G/G полиморфного варианта rs6136 гена SELP имеют более высокие уровни растворимой формы Р-селектина по сравнению с носителями гетерозиготного генотипа G/T.
Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ №0419-2022-0001.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.