Введение
На сегодняшний день широко исследован ряд биомаркеров, позволяющих диагностировать повреждение миокарда, прогнозировать риск инфаркта миокарда (ИМ) и сердечно-сосудистой смерти [1]. Ткань-специфические маркеры некроза миокарда, к которым прежде всего принято относить сердечные тропонины, позволяют достоверно диагностировать ИМ спустя несколько часов после появления симптомов [2]. Новые биомаркеры ишемической болезни сердца (ИБС) и острого коронарного синдрома (ОКС) — микроРНК — отражают различные аспекты развития атеросклероза: воспаление, фиброз, нестабильность атеросклеротической бляшки, активацию тромбоцитов, нейрогормональную активацию [1].
МикроРНК, которые также называют нуклеотидными ключами, являются малым классом некодирующих РНК. Именно эти варианты РНК отличаются одной важной особенностью: они стабильны во всех биологических жидкостях, где выявляются. Причиной этой стабильности являются особенности их транспортировки, которая осуществляется либо в составе внеклеточных микровезикул, либо при помощи циркулирующих белков. Именно эти варианты транспортировки защищают микроРНК от активности РНКазы и таким образом обеспечивают стабильность выявления [3].
Значительное количество недавних исследований рассматривает циркулирующие микроРНК (ц-микроРНК) в качестве потенциальных биомаркеров для диагностики и прогнозирования ОКС [4]. Как и для белковых маркеров ОКС, изменения уровней ц-микроРНК могут возникать на различных этапах атерогенеза [5].
В нашем исследовании анализировали уровень ц-микроРНК плазмы у больных с различными вариантами ОКС (нестабильная стенокардия (НС), ИМ с подъемом сегмента ST (ИМпST) и без такового (ИМбпST)), а также у пациентов со стабильным течением ИБС. Контрольные группы сравнения были сформированы из здоровых мужчин и женщин, а также из пациентов с артериальной гипертензией (АГ), у которых по результатам предварительного инструментального обследования (стресс-тест, компьютерная томография коронарных артерий) была исключена ИБС. Для анализа различий были выбраны микроРНК, которые продемонстрировали перспективность дальнейшего исследования по предшествующим публикациям с точки зрения участия в атерогенезе и различий экспрессии в плазме пациентов с ИБС или ОКС. МикроРНК-кандидаты включали miR-17-5p, miR-92a-3p и miR-126-3p, которые экспрессируются в эндотелиоцитах [6—10] и ранее показали себя как потенциальные маркеры ИБС [6]. В исследование также были включены микроРНК, ассоциированные с воспалением: miR-155-5p и miR-146a-5p [11, 12]. Наиболее распространенные в клетках гладкой мускулатуры сосудов (СГМК) микроРНК, участвующие в процессе пролиферации и апоптоза (miR-21-5p и miR-145-5p [13]), были включены в исследование. Экспрессия miR-21-5p изменяется в сердце и сосудах при сердечно-сосудистых заболеваниях, и, по-видимому, эта микроРНК может использоваться в качестве маркера для различения ОКС и стабильной ИБС [14]. Кроме того, miR-375-3p также была включена в анализ, так как ее экспрессия отличается в плазме больных ИМ, согласно результатам секвенирования циркулирующих микроРНК [15].
Основная цель исследования — проанализировать, различаются ли уровни циркулирующих микроРНК у пациентов с ИБС и лиц без ИБС, у пациентов с ОКС и стабильной ИБС, а также внутри группы ОКС.
Поскольку ряд факторов влияет на измерение содержания ц-микроРНК в крови, мы выполнили основные преаналитические требования, предъявляемые к анализу микроРНК. Это было достигнуто за счет выбора плазмы вместо сыворотки в качестве внеклеточной биожидкости, стандартизированного двухэтапного процесса центрифугирования для выделения свободной от тромбоцитов плазмы, контроля гемолиза образца и использования стабильной эндогенной микроРНК плазмы в качестве контроля относительных измерений экспрессии микроРНК.
Материал и методы
Исследуемая группа
В наше исследование включали пациентов мужского и женского пола в возрасте от 40 до 85 лет. По результатам клинических проявлений, лабораторных и инструментальных методов исследования формировали группы пациентов с ОКС (ИМпST, ИМбпST и НС), стабильным течением ИБС (СИБС), а также пациентов с АГ без ИБС. Контрольную группу здоровых лиц составили лица того же возраста, у которых по результатам обследования не выявлено сердечно-сосудистых заболеваний.
Все заболевания (НС, ИМпST, ИМбпST, СИБС и АГ) диагностировали в соответствии с рекомендациями Российского кардиологического общества (РКО) и Европейского общества кардиологов (ESC). Критерии исключения: хронические заболевания легких, почек, печени в фазе декомпенсации и в терминальной стадии, злокачественное новообразование, злоупотребление алкоголем и наркотическими веществами.
Получение образцов плазмы и их хранение
Цельная кровь была собрана в пробирки с консервантом K2-EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ, США). Полученные образцы крови моментально нумеровали и сохраняли при комнатной температуре не более получаса до момента начала получения плазмы. С момента начала клинических проявлений ИМ до момента забора крови проходило в среднем около 2 сут. С целью получения свободной от тромбоцитов плазмы (СТП) образец цельной крови центрифугировали в два этапа, выделение микроРНК проводили в течение одного месяца после забора крови.
Оценки гемолиза в образцах плазмы
В исследование включали образцы без выявленных признаков гемолиза. Для этого образцы плазмы оценивали визуально, а затем анализировали на спектрофотометре NanoDrop 2000 (ThermoFisherScientific, Waltham, MA, USA). Образцы с HS >0,25 не были включены в это исследование.
Получение образцов микроРНК
Сначала микроРНК выделяли из 30 мкл супернатанта плазмы после центрифугирования с использованием набора Nucleo Spin miRNA Plasma (Macherey-Nagel, Düren, Germany) в соответствии с рекомендациями производителя.
Определения микроДНК: синтез комплементарной ДНК и количественная ПЦР
После получения образцов микроРНК (объем 2 мкл) производили синтез комплементарной ДНК с помощью набора TaqMan Advanced miRNA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, CIF). Одиннадцать коммерчески доступных микроРНК TaqMan Advanced с TaqMan Fast Advanced MasterMix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, CIF) использовали для количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) в соответствии с протоколом производителя (табл. 1). В качестве эндогенного контроля для нормализации была выбрана hsa-miR-16-5p. Мы провели кПЦР с использованием системы QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Влияние гемолиза эритроцитов на ц-микроРНК оценивали на основе обнаруженного с помощью кПЦР отношения гемолиз-зависимой микроРНК miR-451а и miR-23a-3p [16].
Таблица 1. МикроРНК, использованные для кПЦР
| Общепринятое обозначение микроРНК | Функция микроРНК |
| miR-16-5p | Обеспечение нормализации уровней микроРНК |
| miR-375-3p | Биомаркер-кандидат ОКС |
| miR-92a-3p | Биомаркер-кандидат ОКС |
| miR-126-3p | Биомаркер-кандидат ОКС |
| miR-21-5p | Биомаркер-кандидат ОКС |
| miR-146a-5p | Биомаркер-кандидат ОКС |
| miR-155-5p | Биомаркер-кандидат ОКС |
| miR-17-5p | Биомаркер-кандидат ОКС |
| miR-145-5p | Биомаркер-кандидат ОКС |
| miR-23a-3p | Контроль гемолиза |
| miR-451a | Контроль гемолиза |
Анализ данных
U-критерий Манна—Уитни был применен для попарного сравнения относительных уровней микроРНК в плазме и характеристик образцов между исследуемыми группами. Различия значений при p<0,05 считали статистически значимыми. Значения p в анализе множественной линейной регрессии (MLR) были получены с поправкой Бонферрони—Холма для множественных сравнений. Анализировали дополнительные факторы: наличие сахарного диабета 2-го типа, степень выраженности гемолиза (HS, dCq miR-23a-3p-miR-451a значения). Различия считали статистически значимыми при p<0,1.
Результаты
В исследование включены 136 пациентов в соответствии с критериями включения и исключения. На включение больных также влияли требования к качеству образцов плазмы и микроРНК. Все включенные лица были распределены в следующие группы:
— 1-я группа — ОКС (50 пациентов, в том числе 26 с НС и 24 с ИМ); среди пациентов с ИМ было 13 пациентов с ИМпST и 11 пациентов с ИМбпST;
— 2-я группа — СИБС (26 пациентов со стабильной ИБС);
— 3-я группа — АГ (30 больных с АГ без ИБС);
— 4-я группа — контрольная группа (30 здоровых мужчин и женщин).
Основные характеристики исследуемых групп выборки представлены в табл. 2.
Таблица 2. Характеристики групп исследуемой выборки
| Показатель | Контрольная группа | АГ | СИБС | ОКС | Всего |
| Всего пациентов, n | 30 | 30 | 26 | 50 | 136 |
| Возраст, годы | 47,2±5,5 | 57,6±9,6 | 64,8±7,6 | 61,1±10,9 | 58,0±10,7 |
| Пол, n (мужчины/женщины) | 15/15 | 17/13 | 5/11 | 40/10 | 87/49 |
| Наличие СД 2-го типа, n | 0 | 0 | 6 | 13 | 19 |
| Гиперлипидемия, n | 0 | 7 | 22 | 35 | 64 |
| Наличие АГ, n | 0 | 30 | 24 | 42 | 96 |
| Наличие ФП, n | 0 | 0 | 1 | 2 | 3 |
| Наличие ИМ в анамнезе, n | 0 | 0 | 0 | 16 | 16 |
| Коронарный атеросклероз, n | 0 | 0 | 15 | 34 | 49 |
| Липидный спектр | |||||
| общий холестерин, ммоль/л | 4,56±0,8 | 5,18±0,9 | 5,34±1,3 | 4,96±1,4 | 4,97±1,19 |
| триглицериды, ммоль/л | 1,12±0,3 | 1,47±0,6 | 1,62±0,6 | 1,81±0,7 | 1,54±0,6 |
| ЛПНП, ммоль/л | 2,13±0,6 | 2,68±0,7 | 2,97±1,0 | 2,97±1,2 | 2,80±1,0 |
| ЛПВП, ммоль/л | 1,86±0,5 | 1,84±0,5 | 1,53±0,6 | 1,06±0,3 | 1,51±0,6 |
| Медикаментозная терапия | |||||
| бета-адреноблокаторы, n | 2 | 15 | 23 | 24 | 64 |
| антагонисты кальция, n | 0 | 4 | 13 | 4 | 21 |
| иАПФ, n | 0 | 12 | 12 | 32 | 56 |
| диуретики, n | 0 | 4 | 9 | 16 | 29 |
| нитраты, n | 0 | 1 | 9 | 2 | 12 |
| антиагреганты, n | 0 | 9 | 17 | 42 | 68 |
| антикоагулянты, n | 0 | 3 | 9 | 16 | 28 |
| статины, n | 1 | 11 | 20 | 41 | 73 |
| Оценка гемолиза | |||||
| HS | 0,124±0,046 | 0,143±0,052 | 0,102±0,032 | 0,122±0,053 | 0,122±0,051 |
| dCq (miR-23a-3p — miR-451a) | 11,11±1,0 | 11,57±1,1 | 11,02±1,1 | 10,73±1,2 | 11,06±1,2 |
Примечание. СД — сахарный диабет; ФП — фибрилляция предсердий; иАПФ — ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента; ЛПНП — липопротеины низкой плотности; ЛПВП — липопротеины высокой плотности; HS — показатель гемолиза.
Большинство (~60%) пациентов с НС из 1-й группы (ОКС) имели в анамнезе ИМ (средний период после последнего ИМ 7,3 года). У большинства пациентов с ИМ уровень тропонина Т (ТнТ) в плазме составил 0,2—4,6 нг/мл со средним значением 1,6 нг/мл. У двух пациентов с ИМпST уровень ТнТ был значительно повышен (8,3 и 22,0 нг/мл).
Уровни плазменных ц-микроРНК
Все микроРНК обнаруживали в плазме с помощью метода кПЦР со средними значениями Cq от 13,9 до 29,6. Для оценки согласованности наших данных с российскими и зарубежными исследованиями профилей микроРНК в плазме сравнивали относительные уровни микроРНК в плазме с уровнями, представленными в двух публикациях, где использовали секвенирование малых РНК в плазме здоровых взрослых [17, 18]. Согласованность результатов между двумя исследованиями секвенирования анализируемых микроРНК была выше, чем между нашими результатами и любым из этих исследований. Хотя направление изменений для большинства микроРНК между собой было сходным, наше исследование показало значительно более низкие относительные уровни в плазме для большинства miR-16-5p-нормализованных микроРНК по сравнению с данными микроРНК секвенирования.
Уровень ц-микроРНК у пациентов со СИБС и ОКС
Мы сравнили относительные уровни анализируемых микроРНК в плазме между группами исследования, используя критерий Манна—Уитни для попарных сравнений. На рисунке представлены диаграммы распределения относительного уровня микроРНК в исследуемых группах образцов.
Относительные уровни микроРНК в плазме в группах исследования.
На оси ординат показаны относительные уровни микроРНК в плазме (нормализованные к miR-16-5p).
Как видно из представленных данных, уровни miR-17-5p у пациентов с ОКС и СИБС были значимо снижены по сравнению со здоровыми лицами контрольной группы и пациентами группы АГ (табл. 3).
Таблица 3. Результаты попарных сравнений исследуемых образцов при выявлении различий относительных уровней микроРНК в плазме
| Вид микроРНК | Достоверность (вариант анализа) | Группы сравнения | |||||
| ОКС/Контроль | ОКС/АГ | ОКС/СИБС | СИБС/Контроль | СИБС/АГ | АГ/Контроль | ||
| miR-126-3p | ОУ | 1,54 | 1,76 | 1,27 | 1,22 | 1,4 | 0,88 |
| p<0,05 (М—У) | * | ||||||
| p<0,05 (М—У_кор) | |||||||
| p<0,1 (МЛР) | |||||||
| miR-145-5p | ОУ | 0,94 | 1,37 | 0,99 | 0,95 | 1,38 | 0,69 |
| p<0,05 (М—У) | |||||||
| p<0,05 (М—У_кор) | |||||||
| p<0,1 (МЛР) | |||||||
| miR-146a-5p | ОУ | 2,8 | 2,26 | 1,98 | 1,38 | 1,14 | 1,3 |
| p<0,05 (М—У) | * | * | * | * | |||
| p<0,05 (М—У_кор) | * | * | |||||
| p<0,1 (МЛР) | * | * | * | ||||
| miR-155-5p | ОУ | 1,8 | 1,72 | 1,61 | 1,12 | 1,07 | 1,05 |
| p <0,05 (—У) | |||||||
| p<0,05 (М—У_кор) | |||||||
| p<0,1 (МЛР) | |||||||
| miR-17-5p | ОУ | 0,43 | 0,7 | 0,94 | 0,46 | 0,64 | 0,8 |
| p<0,05 (М—У) | * | * | * | * | * | ||
| p<0,05 (М—У_кор) | * | * | * | * | |||
| p<0,1 (МЛР) | * | * | * | * | * | ||
| miR-21-5p | ОУ | 2,69 | 2,43 | 1,79 | 1,6 | 1,37 | 1,12 |
| p<0,05 (М—У) | * | * | * | * | * | ||
| p<0,05 (М—У_кор) | * | * | * | * | * | ||
| p<0,1 (МЛР) | * | * | * | * | |||
| miR-375-3p | ОУ | 0,46 | 0,95 | 0,79 | 0,58 | 1,19 | 0,49 |
| p<0,05 (М—У) | * | ||||||
| p<0,05 (М—У_кор) | * | ||||||
| p<0,1 (МЛР) | * | * | |||||
| miR-92a-3p | ОУ | 1,16 | 1,26 | 1,28 | 0,92 | 0,99 | 0,94 |
| p<0,05 (М—У) | * | * | |||||
| p<0,05 (М—У_кор) | * | * | |||||
| p<0,1 (МЛР) | |||||||
Примечание. * — статистически значимые различия между группами; ОУ — относительный уровень (изменения относительных уровней микроРНК в плазме для попарных сравнений).
Значимые различия отмечали и при анализе микроРНК miR-21-5p и miR-146a-5p (см. рисунок, табл. 3). При сравнении относительных уровней этих микроРНК у пациентов со СИБС и здоровых лиц контрольной группы было выявлено повышение относительных уровней этих микроРНК в патологической группе ИБС.
Также было отмечено повышение уровня плазменной miR-21-5p при сравнении больных СИБС с пациентами с АГ: этот показатель был выше у пациентов со СИБС. При этом у больных ОКС уровни miR-146a-5p и miR-21-5p плазмы были более чем в 2 раза повышены при сравнении со всеми остальными участниками исследования.
Наше исследование также продемонстрировало увеличение в 1,5—1,75 раза относительных уровней miR-126-3p и miR-155-5p у больных ОКС при сравнении с пациентами с АГ и здоровыми лицами контрольной группы.
Чтобы оценить, различаются ли относительные уровни микроРНК в плазме исследуемых образцов, учитывая возможное влияние гемолиза и наличие СД 2-го типа, был проведен анализ множественной линейной регрессии со смешанными факторами (СД 2-го типа и индексами гемолиза) (см. табл. 3). Результаты этого анализа продемонстрировали относительный уровень miR-21-5p в качестве независимого биомаркера-кандидата ОКС. Пониженная экспрессия miR-17-5p позволила дифференцировать пациентов с ОКС и СИБС от больных АГ и здоровых лиц контрольной группы.
При этом повышенная экспрессия биомаркера-кандидата miR-146a-5p была характерна для пациентов с ОКС при сравнении и с больными СИБС, и со здоровыми лицами контрольной группы.
Суммируя все вышеизложенное, можно сделать вывод, что повышенная экспрессия miR-146a-5p и miR-21-5p в плазме является возможным маркером ОКС, а пониженная экспрессия miR-17-5р в плазме может рассматриваться как маркер ИБС, характерный как для ОКС, так и для СИБС. Для других анализируемых микроРНК изменения у больных ОКС при сравнении с пациентами других групп не были выражены.
Кроме того, при сравнении в группе ОКС относительных уровней miR-17-5p, miR-146a-5p и miR-21-5p у пациентов с ИМ (ИМпST и ИМбпST) и НС статистически значимых различий мы не получили (критерий Манна—Уитни, p>0,05). При этом относительные уровни miR-17-5, m1iR-146a-5p и miR-21-5p не коррелировали с уровнем ТнТ у пациентов с ИМ.
Обсуждение
В настоящее время проводится множество исследований по выявлению основных ц-микроРНК крови у пациентов с ОКС, однако имеющиеся данные противоречивы. В этом исследовании мы провели анализ ц-микроРНК плазмы у пациентов со СИБС и ОКС.
Мы сочли необходимым обратить особое внимание на преаналитические параметры, поскольку они необходимы для корректности измерения.
При использовании в статистическом анализе факта наличия СД 2-го типа и показателей гемолиза как искажающих факторов мы отметили изменение относительных уровней большинства исследуемых микроРНК у больных ОКС или СИБС по сравнению со здоровыми лицами контрольной группы или пациентами с АГ без ИБС. Мы уверены, что существует по меньшей мере несколько причин, препятствующих общепринятому использованию микроРНК в качестве диагностического биомаркера:
1) измерение уровней микроРНК в плазме крайне чувствительно к преаналитическим факторам, включая протокол подготовки плазмы, гемолиз образца плазмы, метод обнаружения микроРНК и стратегию нормализации;
2) активация тромбоцитов in vivo или in vitro существенно влияет на уровни микроРНК в плазме [19—21].
3) антитромбоцитарные препараты, антикоагулянты и другие лекарственные препараты могут изменять профили микроРНК в плазме [20, 22].
Одним из самых главных результатов нашего исследования является более чем двукратное увеличение относительных уровней miR-21-5p и miR-146a-5p плазмы у пациентов с ОКС по сравнению со здоровыми лицами контрольной группы, а также с больными АГ и пациентами со СИБС.
Можно предположить, что повышенные уровни этих биомаркеров-кандидатов отражают общие этапы атерогенеза и развития ИБС, поскольку их относительные уровни были выше у пациентов со СИБС при сравнении с больными АГ и здоровыми лицами контрольной группы. Указанные два биомаркера-кандидата являются одними из наиболее популярных по публикациям, посвященным микроРНК. Известно, что они активируются при ОКС, но этой активации не наблюдается при стабильном течении ИБС [23]. По результатам нашего исследования значительно повышенные уровни этих микроРНК были при любом варианте ОКС: мы не отметили статистически значимых различий между пациентами с ИМпST, ИМбпST и НС. В недавних исследованиях с использованием анализа микроРНК TaqMan Advanced для обнаружения циркулирующей микроРНК относительный уровень miR-21-5p в плазме был повышен как в группах пациентов с ИБС, так и в группах больных с хронической сердечной недостаточностью по сравнению с контролем [14, 24]. Представляется также важным, что повышение уровней этих микроРНК уже неоднократно упоминалось при состояниях, ассоциированных с воспалением [25, 26]. При этом, по нашим результатам, у пациентов с ОКС уровень других микроРНК, ассоциированных с воспалением, либо не был повышен (miR-145-5р), либо его повышение было незначительным (miR-155-5р).
При сравнении пациентов с ОКС и СИБС с лицами контрольной группы отмечалось более чем двукратное снижение уровня miR-17-5p. Этот же вариант микроРНК среди пациентов с АГ продемонстрировал более высокий (в 1,6 раза) относительный уровень по сравнению с пациентами группы ОКС и СИБС. В доступной на сегодняшний день литературе имеющиеся данные о miR-17-5p как маркере ИБС и ОКС противоречивы [27, 28].
По сути, в нашем исследовании было две контрольные группы (пациенты с АГ без ИБС и здоровые лица). Подобным образом ранее формировались контрольные группы для выявления биомаркеров-кандидатов у пациентов с пароксизмальной формой фибрилляции предсердий [29].
Мы осознаем, что в нашей когорте имеются половые и возрастные различия между здоровыми лицами контрольной группы и пациентами с ИБС, что является естественным и неизбежным в силу особенностей патогенеза ИБС.
Другое важное ограничение данного исследования — разница во времени между ИМ и взятием крови у больных (от нескольких часов до нескольких дней). Представляется логичным, что плазменные уровни некоторых микроРНК, особенно сердечно-специфических, могут резко изменяться в постинфарктном периоде [30]. Однако это ограничение не могло быть преодолено в существующих клинических условиях из-за особенностей организации помощи таким пациентам.
В заключение хотелось бы сказать, что анализ преаналитических и аналитических условий, вариантов медикаментозной терапии и факта наличия сопутствующих заболеваний представляется крайне важным. При этом указанные выше ограничения не препятствовали проведению нашего исследования в соответствии с последними международными рекомендациями по исследованию ц-микроРНК. Полученные результаты являются важным дополнением базы данных биомаркеров-кандидатов ОКС и СИБС.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.