Введение

Все большая доступность компьютерной томографии (КТ), позволяющей визуализировать внутрилегочные очаги с минимальными размерами, повышает шансы больных на своевременное лечение при ранних стадиях рака легкого (РЛ). Большинство операций при раннем периферическом немелкоклеточном РЛ выполняют путем малоинвазивного доступа — торакоскопии [1]. Торакоскопия, характеризуясь целым рядом преимуществ по сравнению с открытой операцией, имеет и недостатки, одним из которых является невозможность пальпации очагов. При этом даже проведения ручной или инструментальной пальпации далеко не всегда достаточно для обнаружения новообразований небольших размеров либо новообразований с отсутствием солидного компонента («матовое стекло», GGO). Попытка максимального сохранения легочной паренхимы (сегментэктомия, краевая резекция легкого, субсегментэктомия) приводит к увеличению частоты положительного края степлерной резекции [2].

Такие методы точной локализации новообразований легких, как специальные «якорные» спирали, установка разных маркеров при КТ, 3D-планирование, радиоактивные метки, красители, интраоперационный ультразвук, не нашли широкого распространения в связи с целым рядом ограничений и осложнений (пневмоторакс, кровотечение, воздушная эмболия, необходимость специального оборудования, привлечения дополнительных специалистов и др.). Срочное интраоперационное исследование краев резекции характеризуется высокой частотой ложноотрицательных результатов [3].

Преодоление этих недостатков все чаще связывают с интраоперационной флюоресцентной визуализацией в ближнем инфракрасном (БИК) диапазоне спектра, также известной как «хирургия под флюоресцентным контролем» или «интраоперационная молекулярная визуализация» [4, 5]. Такой подход был предложен относительно недавно и изучается пока в небольшом количестве исследовательских центров в мире, однако уже сформулировано заявление экспертов разных стран о том, что флюоресцентная визуализация в БИК-спектре является эффективной и безопасной технологией и необходимо продолжить исследования для оптимизации ее использования [6, 7].

Цель настоящего обзора — обобщение имеющихся данных о флюоресцентной навигации с помощью классических и новых таргетных БИК-красителей применительно к РЛ.

Флюоресцентная визуализация опухолей легких в БИК-диапазоне

Для интраоперационной флюоресцентной визуализации в БИК-диапазоне необходимо соблюдение двух условий — наличие соответствующего экзогенного агента, который селективно накапливается в опухолевой ткани, и специальной системы (камеры), обеспечивающей этот вид визуализации. Преимущества технологии — безопасность для больного и медицинского персонала, простота использования, отсутствие радиации, минимальное удлинение времени операции, возможность коррекции действий хирурга в реальном времени и, что очень важно при выполнении открытых операций, возможность работы в светлом помещении.

Системы визуализации

Системы флюоресцентной визуализации для БИК-диапазона разрабатываются около двух десятков лет, но коммерчески доступными они стали относительно недавно [4]. Современные модели позволяют визуализировать одновременно с флюоресцентным обычное изображение в белом свете, что делает их использование максимально удобным. В качестве источника ИК-излучения используют как лазеры, так и светодиоды. Важной составляющей таких систем является также специальное программное обеспечение. Разработаны и применяются первые отечественные системы для БИК-визуализации [8—10].

Флюоресцентные агенты

Индоцианин зеленый (ИЦЗ)

ИЦЗ является первым и до настоящего времени основным флюорофором, используемым для визуализации периферических легочных новообразований в БИК-диапазоне. Полоса поглощения света находится в диапазоне 750—810 нм, а пик эмиссии — около 830 нм [11]. Различные аспекты, связанные с применением ИЦЗ в бронхоскопии и торакальной хирургии, рассмотрены в специальных обзорах [12—16].

В водной среде ИЦЗ склонен к образованию молекулярных агрегатов, которые флюоресцируют плохо. После внутривенного введения ИЦЗ связывается с белками плазмы крови, что приводит к значительному увеличению интенсивности флюоресценции. Так, например, конъюгат ИЦЗ с альбумином флюоресцирует в 180 раз сильнее водного раствора [17]. Еще больше усиливает флюоресценцию химическая связь с липопротеидами высокой плотности [18]. ИЦЗ выводится из организма в основном с желчью со скоростью около 0,1 мг/мин/кг. Периоды полувыведения составляют 3—4 мин (ранняя фаза) и 30—50 мин (поздняя фаза) [11].

Местное введение ИЦЗ в ряде торакальных центров используют для маркировки периферических опухолевых узлов, чтобы облегчить их обнаружение во время операции. Процедуру проводят перед операцией путем инъекции непосредственно в опухоль небольшой дозы ИЦЗ (2,5 мг/мл, 0,3—1 мл) под контролем КТ или бронхоскопии [19]. Однако эта методика обеспечивает визуализацию только места вкола, не позволяя локализовать край новообразования; в настоящем обзоре она не рассматривается.

Системное введение препарата с расчетом на накопление его в опухоли связывают с эффектом «повышенной проницаемости и удержания». Этот эффект, впервые описанный 1986 г. [20], основан на несовершенном развитии новообразованных сосудов опухоли ввиду их сверхбыстрого роста и большом расстоянии между эндотелиальными клетками (от 600 до 800 нм). Молекулы ИЦЗ, связанные с белками плазмы, выходят за пределы сосудов и задерживаются в межклеточном пространстве. Поскольку препарат попадает и в здоровую ткань, требуется выбрать оптимальные условия визуализации, обеспечивающие максимальный диагностический контраст (ДК) — отношение интенсивностей флюоресценции опухоли к окружающей ткани.

Одной из важных проблем в реализации технологии интраоперационной ИЦЗ-флюоресценции опухолей легких остается подбор оптимальной дозы вводимого препарата, а также срока его введения перед операцией. В исследовании на мышиных моделях оптимальной была признана дозировка 5 мг/кг за 24 ч до операции, при этом уровень ДК достигал 2,1—8,0 [21]. Последующие клинические исследования подтвердили, что эти результаты применимы и к пациентам с РЛ. Особенность такого подхода заключается в использовании сверхбольшой дозы ИЦЗ — 10—20 флаконов по 25 мг вместо одного, которого обычно более чем достаточно для других применений ИЦЗ. Тем не менее, как показала клиническая практика, такая доза не вызывала серьезных токсических реакций и в настоящее время метод, известный под названием TumorGlow, используют для интраоперационной локализации целого ряда солидных опухолей [22—24].

Результаты первого применения технологии TumorGlow в торакальной хирургии опубликованы в 2014 г. [22]. Интраоперационная БИК-визуализация выявила флюоресценцию 16 из 18 периферических очагов легких, а также 5 дополнительных субсантиметровых метастатических новообразований: 3 аденокарциномы и 2 саркомы. Впервые у человека удалось продемонстрировать возможность идентификации легочных узлов с помощью БИК-визуализации с использованием ИЦЗ без предварительного знания их наличия или местоположения. Идентифицированы были очаги размером от 0,2 см и глубиной до 1,3 см от поверхности плевры. Эти результаты подтвердились и в исследованиях других авторов [25].

В дальнейшем было показано, что оптимальная доза ИЦЗ зависит от гистологического варианта опухоли. Более низкая доза ИЦЗ (от 2 до 3 мг/кг) эффективна при вторичном (метастатическом) РЛ, а при первичном РЛ необходима более высокая доза (от 4 до 5 мг/кг) [26].

По данным метаанализа клинических исследований с использованием ИЦЗ в качестве флюоресцентного агента при РЛ, опубликованного в 2022 г., чувствительность in situ составляет 86,4—89,3%, доля ложноотрицательных и ложноположительных результатов — 9,1—13 и 11,8—18,2% соответственно [16]. Ложноположительные поражения наблюдались при воспалении и ателектазе, что делало корректную оценку краев резекции невозможной [22, 26]. Дальнейший анализ технологии TumorGlow предполагается в клиническом исследовании I/II фазы [https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04723810] (планируемый срок проведения 2023—2026 гг.). В исследование должны быть включены 500 пациентов с солидной опухолью легкого и других органов. Цель исследования — определить безопасность, оптимальную дозу ИЦЗ и интервал до диагностики, позволяющий обеспечить максимальное значение ДК в зависимости от типа опухоли, а также оценить специфичность и чувствительность флюоресцентной диагностики.

Таргетные флюоресцентные агенты БИК-диапазона

Основным недостатком ИЦЗ является его неспецифичность. Это определяет необходимость поиска новых флюорофоров, направленных на накопление в злокачественной опухолевой ткани.

OTL38. Первым таргетным флюорофором был OTL38, который одобрен для медицинского применения в США в ноябре 2021 г. при раке яичников и РЛ и выпускается под торговой маркой Циталюкс (пафолацианин). Этот препарат взаимодействует с α-рецептором фолата (FRα), который экспрессируется в 72—87% аденокарцином и 13—57% плоскоклеточных карцином легкого. Описание его структуры, синтеза, физических характеристик и диагностических возможностей содержится в ряде работ [27, 28]. OTL38 представляет собой молекулу, состоящую из фолата, конъюгированного с флюоресцентным БИК-красителем S0456, с пиком поглощения 776 нм и пиковым излучением 796 нм. Квантовый выход флюоресценции 15,1% (у ИЦЗ — 9,3%). Доза препарата составляет 0,025 мг/кг, интервал от введения до диагностики — от 3 до 6 ч.

Анализ 6 клинических исследований применения OTL38, в которые включены 465 пациентов с 505 узлами в легких, обнаруженных при КТ, показал, что 53,8—100% очагов флюоресцировали во время операции, при этом средний ДК составлял 2,4—3,8. Было выявлено 40 дополнительных образований, из них 25 злокачественных. Доля ложноотрицательных и ложноположительных результатов составляла 0—38,5 и 0—12,9% соответственно. Большинство ложноположительных результатов было связано с гранулематозами, а ложноотрицательных — с глубоким внутрилегочным расположением опухоли [16]. Удивительно, но не отмечено существенной разницы в интенсивности флюоресценции при злокачественных и доброкачественных новообразованиях [29]. Чувствительность метода у пациентов с аденокарциномой (84%) оказалась выше, чем у пациентов с плоскоклеточным раком (58,3%) [27], что соответствует разнице в экспрессии FRα. Не было обнаружено существенной корреляции между интенсивностью флюоресценции, SUVmax при предоперационной позитронно-эмиссионной томографии/КТ и размером новообразования. Самое глубокое из обнаруженных флюоресцирующих опухолевых поражений располагалось на глубине 20 мм от поверхности легкого. Существенными ограничениями большинства исследований являлись небольшой размер выборки и возможная необъективность исследователей в связи с отсутствием количественного метода оценки интенсивности флюоресценции [30].

В двенадцатицентровом клиническом исследовании, включающем 112 пациентов с периферическими новообразованиями легких, флюоресценция позволила выявить у 8 больных 10 оккультных очагов, которые были невидимы в белом свете (8%); большинство (70%) этих новообразований, находились за пределами запланированного участка резекции [31]. Последнее исследование на эту тему, опубликованное в 2023 г., показало, что высокая вероятность ложноотрицательных результатов при применении пафолацианина связана с муцинозной аненокарциномой и длительным стажем курения (более 30 лет) [32]. Однако основным преимуществом пафолацианина по сравнению с ИЦЗ являлось существенное снижение дозы — в 200 раз (с 5 до 0,025 мг/кг).

Другие таргетные флюорофоры. В США в настоящее время на разных стадиях исследований находятся около 40 новых контрастных веществ для молекулярной визуализации, обладающих улучшенными физико-химическими свойствами и характеристиками нацеливания. Ниже содержатся сведения, касающиеся таргетных агентов, изучаемых в клинических условиях.

Проводятся клинические исследования по изучению двух конъюгированных с моноклональными антителами флюоресцентных красителей — нимотузумаб-IRDye800CW (NCT04459065) и панитумумаб-IRDye800CW (NCT03384238). Оба этих флюорофора нацелены на мутацию рецептора эпидермального фактора роста EGFR, т.е. ожидаемый охват больных РЛ является небольшим [16]. Еще в одном исследовании (NCT03735680), включающем разные типы первичных опухолей, изучается препарат ONM-100 — pH-чувствительный амфифильный полимер, конъюгированный с ИЦЗ, который активируется в кислой внеклеточной среде опухоли. Другую молекулу — SGM-101, представляющую собой антитело против ракового эмбрионального антигена в сочетании с флюорохромом BM104, изучают у пациентов с внутрилегочными очагами в рамках многоцентрового пилотного исследования (NCT04315467). Результаты этих работ еще не опубликованы [33]. Перспективной представляется конъюгация антитела к PD-L1 (атезолизумаб) с БИК-красителем для создания флюоресцентного зонда NIR-PD-L1-mAB, клинические испытания уже начаты [16].

Повышение глубины зондирования

Одним из наиболее существенных ограничений оптической диагностики по сравнению с рентгеновской является малая глубина проникновения излучения.

Первое оптическое окно БИК-диапазона (БИК-I, 650—950 нм), в котором реализуются все приведенные выше методы диагностики, обеспечивает эффективное проникновение излучения на глубину до 10 мм [16]. К приводимым в некоторых работах глубинам флюоресцентной визуализации около 20 мм нужно относиться с осторожностью. Кроме того, принципиально обнаружить участок флюоресценции легче, чем полноценно визуализировать границы опухоли.

Второе окно ближнего инфракрасного диапазона

Второе оптическое окно БИК-излучения (БИК-II) находится в диапазоне от 1000 до 1700 нм. Из-за меньшего рассеяния и поглощения фотонов в биологической ткани визуализировать опухоль в диапазоне БИК-II можно на большей глубине по сравнению с БИК-I, что показано в ряде экспериментов [34]. Прежде чем эту возможность можно будет реализовать в клинических условиях, необходимо преодолеть несколько ограничений. Большинство современных флюоресцентных молекул БИК-II обладает плохой химической стабильностью и является гидрофобным, а также характеризуется высокой токсичностью, медленно метаболизируется, а различные молекулярные взаимодействия приводят к уменьшению интенсивности их флюоресценции. Кроме того, в настоящее время доступно лишь несколько систем для визуализации БИК-II, причем такие камеры достаточно дороги. Существует экспериментальный образец прибора, в котором обеспечена возможность одновременной визуализации флюоресценции в БИК-I и БИК-II. Его применение при хирургическом удалении первичных и метастатических опухолей печени у 23 больных с использованием ИЦЗ показало, что визуализация БИК-II обеспечила бо́льшую чувствительность обнаружения опухоли, чем БИК-I, за счет в том числе более высокого контраста [35].

Фотоакустическая визуализация

Перспективным исследуемым методом является также фотоакустическая визуализация, обеспечивающая глубину проникновения до 7 см. Метод основан на поглощении импульсно-периодического лазерного излучения, вызывающего термоупругое локальное расширение, что приводит к излучению акустических волн, обнаруживаемых ультразвуковм датчиком. Генерация звуковых волн может иметь место при поглощении света как эндогенными молекулами (например, меланином или гемоглобином), так и экзогенными (например, ИЦЗ или специальными наночастицами) [36]. Фотоакустическая визуализация дифференцирует различные ткани, так как разница в скорости поглощения света вызывает разные акустические волны. Проведены лишь первые доклинические исследования, изучающие возможности фотоакустической визуализации внутрилегочных очагов [37].

Количественная оценка флюоресценции

Оценка флюоресценции чаще всего носит субъективный характер. Количественная оценка степени флюоресценции принципиально важна, так как позволяет объективизировать получаемую визуальную информацию. Решение этой задачи не является простым, поскольку на сигнал флюоресценции влияет множество факторов [38]. Для преодоления этих сложностей разрабатываются специальное оборудование, программное обеспечение и эталонные образцы в системе MMCscope-ICG [10].

Сочетание флюоресцентной диагностики с фотодинамической терапией

Флюоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия (ФДТ) являются составляющими тераностического подхода, который может быть реализован во время одной процедуры с помощью одного химического вещества. Такая технология успешно осуществлена при эндобронхиальном лечении РЛ под флюоресцентным контролем с помощью фотосенсибилизаторов хлоринового ряда [39]. В БИК-диапазоне в качестве фотосенсибилизатора можно использовать ИЦЗ, однако эффективность лечебного эффекта в данном случае оказывается небольшой [9, 17].

Для ФДТ в БИК-диапазоне предложено использовать наночастицы золота, связанные с матричной металлопротеиназой MMP2 в качестве таргетного лиганда и с красителем — йодидом IR-780. Такая молекула должна обеспечить возможность как флюоресцентной визуализации в БИК-диапазоне и фотоакустической визуализации, так и фотодинамического и даже фототермического воздействия. Эффективность препарата была проверена на мышиной модели карциномы легкого (A549). Облучение лазерным излучением (808 нм), наряду с флюоресцентной визуализацией, приводило к нагреву опухоли до 46 °C и значительному подавлению ее роста [40]. Предложен целый ряд других типов нанопрепаратов, однако доступными для исследований с участием человека они будут, по-видимому, очень нескоро.

Более реальным для клинического применения может быть совместное введение в организм больного ИЦЗ и хлорина е6. Реализация такого подхода с целью эндобронхиальной фотодинамической тераностики при РЛ уже осуществлена, показана возможность выявления с помощью флюоресценции участков опухоли, которые затем подвергаются прицельной ФДТ [9,15]. Такой подход можно использовать и во время проведения резекционных операций, при которых задача ИЦЗ-визуализации — помощь хирургу в определении объема резекции, а хлорина е6 — в проведении ФДТ краев резекции.

Заключение

Применение флюоресцентной визуализации в хирургии периферического РЛ началось относительно недавно, и уже получены результаты, подтверждающие перспективность данного направления. Основное преимущество этой оптической технологии заключается в простоте и безопасности ее применения в клинических условиях. Однако у обоих флюоресцентных препаратов, протестированных в исследованиях с участием человека (ИЦЗ и OTL38), недостаточно специфичности — они могут накапливаться и в доброкачественных опухолях, а также в участках воспаления или ателектаза. Более специфичные для РЛ агенты находятся на разных стадиях исследований. Другим ограничением данной технологии является не всегда достаточная глубина визуализации. Перспективными в этом отношении могут оказаться переход на большие длины волн ИК-диапазона и применение метода фотоакустической визуализации.

Интраоперационная визуализация может рассматриваться в составе комбинированных тераностических методов, в которых лечебная составляющая базируется не только на хирургическом удалении опухоли, но и на адресной доставке лекарств и прицельном фотодинамическом или фототермическом воздействии. Успехи такого подхода будут определяться в первую очередь разработкой новых таргетных флюорофоров.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.