Половым путем могут передаваться более 30 различных бактерий, вирусов и паразитов [1]. Часто инфекции, передаваемые половым путем, (ИППП) протекают асимптомно и определяются только лабораторно, поэтому выявление возбудителя имеет решающее значение в борьбе с ИППП.
Цель данного обзора — изучение и обобщение данных литературы о современных методах диагностики ИППП, применяемых в клинической практике, а также находящихся на этапах разработки.
Выделяют две группы методов диагностики сифилиса: прямые и непрямые. Прямые методы диагностики позволяют выявить возбудителя или его генетический материал, из них самый старый метод — темнопольная микроскопия. Более новым методом является прямое флуоресцентное окрашивание мазков с помощью антител к Tr. pallidum, что позволяет дифференцировать патогенные и непатогенные трепонемы [2, 3]. К прямым методам относят и различные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР). На ранней стадии заболевания используют качественную и мультиплексную ПЦР, для подтверждения заболевания — Nested и Real-Time ПЦР [4]. К менее распространенным прямым методам относят гистологическое и иммуногистохимическое исследования [2, 3]. Методика культивирования Tr. pallidum позволила получить изогенные штаммы in vitro [5] и выполнить трансгенную замену псевдогена tprA на ген устойчивости к канамицину в геноме Tr. pallidum [6], что важно для разработки вакцины.
Непрямые (серологические) методы диагностики делят на трепонемные и нетрепонемные. Из нетрепонемных тестов применяют RPR (Rapid Plasma Reagin) и VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) [7]. Ввиду их недостаточной специфичности разработана платформа электрохимического биосенсора на основе RPR-теста для обнаружения антител к кардиолипиновому антигену [8]. К трепонемным тестам относят: FTA-ABS (Fluorescent treponemal antibody absorption test), TPPA (Treponema pallidum particle agglutination), ИФА (иммуноферментный анализ). Тесты не дают возможности оценить эффективность лечения и, по мнению ряда авторов, отличить активную стадию от ранее перенесенной инфекции [2, 3].
Актуальность приобретают point-of-care тесты (POCT), проводимые «на месте оказания помощи». Большинство таких тестов способны выявлять только специфические антитела и не позволяют дифференцировать стадии заболевания, но уже существуют варианты, например DPP Syphilis Screen & Confirm, которые решают эту проблему [9].
Двойной анализ на ВИЧ/сифилис по методике Dried tube specimens (DTS) заключается в простоте выполнения теста. Панель DTS получают путем высушивания определенного объема плазмы с известными результатами на ВИЧ и сифилис. Также проходят исследования по определению двух инфекций LF-тестами (Lateral Flow Test — тест бокового потока), часть тестов показывает полное совпадение результатов (SD Bioline HIV/Syphilis duo), часть (Chembio DPP HIV-Syphilis) дает ложноотрицательные результаты для ВИЧ [10].
Также идет поиск новых биомаркеров для диагностики сифилиса, например, микроРНК, уровень которых значительно отличается у инфицированных и здоровых людей [11, 12].
Для выявления N. Gonorrhoeae также начинают использовать POCT. FDA (Food And Drug Administration) одобрены 2 POCT: GeneXpert CT/NG — тест сочетает в себе микрофлюидную технологию (позволяет контролировать и работать с небольшим количеством жидкости в замкнутой и ограниченной среде) и ПЦР в реальном времени [13]; Binx health io — настольный прибор, в котором автоматически проводится ПЦР, результат выводится на экран [14].
Принцип работы NAAT (Nucleic Acid Amplification Tests) заключается в многократном увеличении малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновых кислот. Важным параметром при проведении NAAT является температурный режим, поскольку во время каждого этапа рутинной ПЦР температура меняется, и необходим контроль за точностью ее значений. Разработка устройств, позволяющих проводить исследования при постоянной температуре делает данные технологии удобными для применения. Одной из таких платформ для POC-тестов может быть петлевая изотермическая амплификация (проводится при постоянной температуре 64 °C), объединенная с биосенсором на основе полимерных наночастиц для быстрой визуальной оценки результата [15]. Другим перспективным диагностическим прибором, принцип работы которого основан на изотермической амплификации рекомбиназной полимеразы (RPA), является система TwistDx. Наиболее эффективно реакция в данном устройстве проводится при 37–42 °C, но ее можно выполнять и при комнатной температуре [16].
Разработано одноразовое мультиплексное ПЦР-устройство для одновременной диагностики гонококковой инфекции, урогенитальной хламидийной инфекции, урогенитального трихомониаза (Visby Medical Sexual Health Test), которое полностью автоматизировано и позволяет проводить колориметрическую оценку результата. Диагностика проводится во время первого посещения врача [17].
Бумажно-жидкостная платформа для обнаружения N. gonorrhoeae в урогенитальных образцах еще один вариант диагностики, который начинают применять в практике. Это небольшое устройство, в котором клетки образца добавляют в камеру из циклического олефинового полимера, содержащую лизирующий буфер. Реакционная смесь проходит через пористый полиэфирсульфоновый субстрат для осаждения и концентрирования ДНК, после чего происходит амплификация в изотермической термофильной геликазозависимой реакции (tHDA) [18].
Серьезной проблемой является резистентность N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам, поэтому важным направлением в разработке диагностических тестов, является поиск технологий, позволяющих выявлять мутации, обусловливающие устойчивость N. gonorrhoeae к различным антибиотикам одновременно с выявлением возбудителя, например, магнитожидкостная платформа PROMT (portable, rapid, on-cartridge magnetofluidic purification and testing) — портативный прибор для проведения ПЦР (пластиковый картридж с помещенными в него раствором, содержащим магнитные частицы). Все этапы анализа выполняются автоматически при помощи градиента магнитного поля, результаты выводятся на экран смартфона через 15 минут. Технология позволяет обнаружить N. gonorrhoeae в уретральных образцах (ген opa), а также генотипировать его на устойчивость к ципрофлоксацину (ген gyrA) [19].
Система SpeeDx ResistancePlus GC позволяет одновременно обнаружить N.gonorrhoeae (гены opa и PorA) и маркеры gyrA 91(дикий тип) или мутацию gyrA S91F, которые связаны с чувствительностью или устойчивостью к ципрофлоксацину [20]. Анализ на основе Cas13a (специфический высокочувствительный ферментативный репортерный анализ) определяет низкие уровни N.gonorrhoeae (10 копий на реакцию) и резистентность к азитромицину (мутации A2059G и C2611T в 23S рРНК) [21]. Для генотипирования детерминант устойчивости N.gonorrhoeae к цефтриаксону, азитромицину, ципрофлоксацину, пенициллину, тетрациклину разрабатывают технологию на основе гидрогелевого капельного микрочипа, которая может стать альтернативой полногеномному секвенированию, так как позволяет выявлять множество специфичных геномных мишеней [22].
Таким образом, разработка POC-тестов диагностики гонококковой инфекции в сочетании с выявлением устойчивости к антибактериальным препаратам является одним из приоритетных направлений при создании инновационных диагностических устройств ввиду распространенности заболевания и увеличения резистентности N. gonorrhoeae к имеющимся препаратам.
Диагностическим методом для обнаружения T. vaginalis традиционно было микроскопическое исследование нативного препарата, культуральное исследование считали «золотым стандартом» диагностики. Новый метод культурального исследовнаия InPouch TV, обеспечивает прямую инокуляцию, транспортировку, культивирование и микроскопическое исследование образца [23, 24].
Необходимость быстрой диагностики заболевания привела к разработке экспресс-тестов. Набор OSOM Trichomonas Rapid Test представляет собой тест-полоску, работающую на основе иммунохроматографического обнаружения мембранных белков T. vaginalis с использованием мышиных антител и латексных шариков, врач получает результат уже через 10 мин [9, 25, 26]. Системой для качественного обнаружения ДНК T. vaginalis, принцип работы которой основан на изотермической хеликазозависимой амплификации, является Solana Trichomonas, позволяющая обнаружить T. vaginalis за 40 минут [9, 25, 26]. Xpert TV — это первый NAAT T. vaginalis, одобренный FDA. От забора биоматериала до получения результата проходит 60-90 минут [9, 25, 26].
NAAT является лучшим методом диагностики T. vaginalis. Для большинства NAAT требуется сложное лабораторное оборудование, что ограничивает оперативность диагностики. Существуют две роботизированные платформы NAAT для обнаружения T. vaginalis у женщин: тест Aptima TV и тест BD ProbeTec Qx на системе BD Viper. Оба теста имеют высокую чувствительность и специфичность, врач получает результат менее чем за 8 ч [27].
Система BD Max CT/GC/TV (N. gonorrhoeae, C. trachomatis и T. vaginalis) представляет собой мультиплексный анализ в режиме реального времени, с помощью которого можно обнаружить N. gonorrhoeae, C. trachomatis и T. vaginalis [27, 28]. Также три инфекции можно обнаружить с помощью Visby Medical Sexual Health Test — одноразового и компактного устройства, которое позволяет выполнить анализ на основе ПЦР для качественного обнаружения ДНК в течение 30 мин [17, 26].
Технологические исследования в области биосенсоров привели к созданию электрохимического биосенсора ДНК без меток, который сконструирован путем самосборки тиолированного T. vaginalis-специфического зонда на поверхности проводящей тонкой пленки POAP (электрополимеризованного поли(о-аминофенола), одновременно действующей как преобразователь, а также как окислительно-восстановительный индикатор [29]. Для обнаружения T. vaginalis также разработан оптический наногеносенсор, усиленный наночастицами золота [30]. Данные методы рассматривают как перспективные для внедрения в практику.
Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) является наиболее распространенным бактериальным патогеном, передаваемым половым путем [31]. Культуральный метод диагностики был «золотым стандартом», однако, в связи со сложностью и низкой чувствительностью не применяется [32]. Из иммунологических методов при невозможности применения NAAT используют тест прямого флуоресцентного антитела (Direct Fluorescent Antibody, DFA) [32, 33]. Иммунологические исследования с использованием моноклональных антител, специфичных для MOMP C. Trachomatis, имеют специфичность 98–99% и чувствительность 80–90% [32]. Помимо DFA-теста среди иммунологических методов выделяют ИФА, но он дает частые ложноположительные результаты.
Одной из первых молекулярных технологий диагностики C. trachomatis был метод гибридизации нуклеиновых кислот (NAH), на основе которого был создан наиболее часто используемый тест PACE 2 [34]. Другими тестами с использованием ДНК зонда является PACE 2C, для обнаружения C. Trachomatis и Neisseria gonorrhoeae в одном образце и Hybrid Capture II, имеющий чувствительность выше, чем у аналогов. Такие тесты обладают более низкой чувствительностью в сравнении с методами амплификации ДНК [32].
NAATs рекомендуются для диагностики C. trachomatis благодаря их высокой чувствительности, специфичности и скорости [33]. Технология NAAT не позволяет отличить ДНК жизнеспособных и погибших бактерий [35]. Как маркер жизнеспособности бактерий определяют мРНК (матричную рибонуклеиновую кислоту) [36]. Разработан мультиплексный анализ — кПЦР, основанный на двух мультикопийных мишенях, позволяющий обнаружить новые варианты с делециями или рекомбинацией, диагностическая чувствительность и специфичность метода составили 100 и 99,3% соответственно, что показывает возможность его использования в клинической практике [37].
В V-ПЦР («ПЦР жизнеспособности (Viability-PCR)») оценивают жизнеспособность бактерий на основе целостности бактериальной мембраны [35].
POCT для диагностики урогенитальной хламидийной инфекции включают методы NAAT, имеющие значительно лучшие характеристики в сравнении с POCT, основанными на обнаружении антигенов [38, 39, 40]. Morris и соавт. (2021) продемонстрировали результаты исследования одноразового экспресс-устройства ПЦР для выявления N. gonorrhoeae, C. trachomatis и T. vaginalis. В ходе исследования забор биоматериала для тестирования осуществляли сами пациентки, а включали устройство и получали результаты операторы. Для C. trachomatis устройство показало чувствительность 97,4% и специфичность 99,4% [17].
Омикс-технологии (single-cell RNA-Seq) применяют для идентификации ранних биомаркеров C. trachomatis [41]. Исследование профиля мРНК используют в диагностике эндометрита [42]. Разработаны методы анализа по типу «пептидного микрочипа», способные идентифицировать специфические антитела к каждому виду Chlamydia [43, 44] и позволившие идентифицировать 96% C. trachomatis-положительных образцов [43]. Методом 1Н-ЯМР были показаны различия в метаболических профилях между C. trachomatis-положительными и C. trachomatis-отрицательными группами [45, 46]. Метаболомные и другие омикс-технологии являются перспективными методами диагностики, но требуют дополнительных исследований.
Цитологический анализ (тест по Папаниколау, pap-тест) для определения клеток, предположительно инфицированных ВПЧ, начал широко применяться в качестве скринингового теста в XX веке. Pap-тест эффективен и широко используется в настоящее время, однако данный вид анализа субъективен и не позволяет подтвердить наличие ВПЧ. Обнаружить ВПЧ можно с помощью ПЦР. Тестирование ДНК ВПЧ обеспечивает более высокую чувствительность в обнаружении ВПЧ, чем тест по Папаниколау [47, 48], однако для выполнения современных тестов на ВПЧ (Cepheid Xpert и Cobas), требуется хорошо подготовленный персонал, дорогое оборудование и длительное время [49].
Помимо классического ПЦР существуют другие методы: тест на мРНК ВПЧ, исследование метилирования, микроРНК и комбинация изотермической рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA) с CRISPR-Cas12a, индикаторной полоской с латеральным потоком (LFD) и обратным дот-блоттингом (RDB). Комбинированный метод изотермической рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA) с индикаторной полоской с латеральным потоком (LFD) и обратным дот-блоттингом (RDB) позволяет быстро идентифицировать генотипы ВПЧ. Индикаторная полоска показывает наличие или отсутствие вируса, а обратный дот-блоттинг позволяет идентифицировать тип ВПЧ. Данный метод обладает высокой специфичностью к ВПЧ, где консервативные гены L1 используются в качестве целевых генов для амплификации. Методика может применяться для идентификации генотипов ВПЧ в качестве POCT в течение одного часа с высокой чувствительностью, а также важно, что при выполнении данного анализа не требуется специально обученный персонал [50].
Жизненный цикл ВПЧ тесно связан с биологией клетки-хозяина и зависит от дифференцировки кератиноцитов. Вирусный геном состоит примерно из 8 т.п.н. кольцевой двухцепочечной ДНК и 8 открытых рамок считывания, которые кодируются в ранней области (E 1-7) и поздней области (L1 и L2). ВПЧ инфицирует базальный слой эпителия. Эпителиальные клетки дифференцируются по мере того, как они мигрируют к верхним слоям, что неблагоприятно для репликации ВПЧ, поскольку вирус зависит от механизма репликации ДНК хозяина для репликации своего генома. Чтобы поддерживать механизм клеточной репликации, начинают экспрессироваться вирусные белки E6 и E7, инактивируя p53 и pRb, соответственно. Инактивация pRb с помощью E7 заставляет инфицированные клетки оставаться в пролиферативном состоянии и избегать выхода из клеточного цикла, в то время как инактивация p53 с помощью E6 обеспечивает выживание клеток, предотвращая апоптоз. При диагностике ВПЧ важно не только обнаружить вирус, но и определить степень дисплазии эпителия. Тесты на основе выявления мРНК ВПЧ E6/E7 обладают диагностической значимостью для обнаружения CIN2 дисплазии шейки матки [51]. Количество положительных результатов теста на мРНК ВПЧ E6/E7 повышается с увеличением тяжести цитологических или гистологических характеристик [51].
Один из новых методов диагностики — анализ метилирования генов клеток-хозяев. Применяют панель из шести маркеров метилирования генов в цервико-вагинальных выделениях, собранных с первой порцией мочи при помощи специального устройства Colli Pee (Novosanis, Belgium). Значимость каждого отдельного маркера метилирования оценивали с использованием цитологических, или гистологических методов. Значительное повышение уровня метилирования наблюдали для генов GHSR и LHX8 при интраэпителиальной неоплазии, оно имело не только диагностический, но и прогностический характер. Неинвазивный характер позволяет женщинам самостоятельно забирать биологический материал, что расширяет возможности использования метода [52].
Онкогены ВР-ВПЧ E6/E7 регулируют экспрессию микроРНК. Экспрессия микроРНК-218 снижена у пациентов, инфицированных ВПЧ, и она снижается по мере прогрессирования поражения. Профилирование микроРНК можно использовать для многофакторного анализа, определяющего маркеры неоплазии шейки матки [53].
Создан метод на основе Cas12a для обнаружения 13 типов ВПЧ в одной реакции путем объединения метода изотермической рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA) с технологией CRISPR-Cas12a, при которой результат можно получить за 35 мин при сохранении высокой чувствительности [54].
Кроме молекулярно-генетических методов идентифицировать ВПЧ можно с помощью иммунологических методов. В диагностику ВПЧ входит анализ экспрессии белков p16 и Ki-67 методом иммуногистохимии (ИГХ), который применяют для выявления предрака шейки матки у ВПЧ-положительных женщин. Использование двойного окрашивания p16/Ki-67 показало высокую чувствительность и специфичность для выявления предраковых состояний [55]. При неоплазии активность Е7 ВР-ВПЧ приводит к сверхэкспрессии p16. Гистологически негативные ткани всегда были p16-негативными и в 93% случаев также негативными по ВР-ВПЧ [56]. Интенсивность экспрессии p16 и Ki-67 положительно коррелировала со степенью поражения шейки матки [57].
Протеомный и транскриптомный анализы являются новыми методами диагностики ВПЧ. Были подобраны белковые панели, специфичные для различных форм поражений шейки матки, ассоциированных с ВПЧ. Белки первой группы появляются при ранних изменениях и поражении эпителия шейки матки. Белки второй группы — при прогрессировании. Анализ протеома цервиковагинальной жидкости позволяет дифференцировать изменения в эпителии на ранних стадиях развития [58]. При помощи транскриптомного метода анализа была показана корреляция между обнаружением некоторых транскриптов и риском канцерогенеза, связанного с ВПЧ [59].
На данный момент ВОЗ рекомендует ДНК-тестирование в качестве основного метода скрининга ВПЧ [60], но важна и диагностика его биологической активности и степени поражения эпителия.
Можно выделить четыре стратегии диагностики герпеса: культивирование вируса [61], микроскопию образцов, серологические тесты и молекулярные методы. Культивирование вируса обладает низкой чувствительностью, особенно при рецидивирующих формах герпеса. Также чувствительность значительно снижается, если элементы, с поверхности которых был взят материал, находились в стадии эпителизации [62].
К микроскопическим методам можно отнести цитологическое обнаружение клеточных изменений эпителия, связанных с ВПГ (клетки Тцанка). Данный метод диагностики не является чувствительным и специфичным [63].
Серологические тесты включают в себя определение специфических антигенов ВПГ-1, ВПГ-2 или же антител к гликопротеину G2 (ВПГ-2) и G1 (ВПГ-1) в сыворотке или капиллярной крови. Чувствительность метода варьирует в пределах 80-98%, часто ложноотрицательные результаты могут быть в случае недавнего заражения.
К наиболее распространенным молекулярным методам диагностики относят ПЦР и петлевую изотермическую амплификацию (LAMP) [61, 64].
Все эти методы имеют свои достоинства и недостатки, поэтому запрос на создание более совершенных диагностических систем сохраняется. Далее будут рассмотрены новые решения, которые потенциально могут быть использованы в диагностике ВПГ. Тест-полоски с нанофосфорными частицами для домашнего определения ВПГ-2 типа. Известно, что 80% инфицированных ВПГ-2 не знают об этом, отчасти из-за стигматизации, связанной с лабораторным тестированием на ИППП. В ответ на данный социальный запрос были разработаны специальные тест-полоски, которые можно использовать в домашних условиях. Метод основан на выявлении поздних антител (IgG) к вирусному гликопротеину G2. Результаты могут интерпретироваться с помощью специального приложения на смартфоне (репортерная конструкция активируется от вспышки камеры) [65].
Компьютерная визуализация ВПГ с использованием встроенного микроскопа. Данный метод относится к POCT. Он заключается в использовании подложки с антителами к ВПГ, которые связывают и фиксируют вирусные частицы, с последующей съемкой на голографическом микроскопе. Это устраняет необходимость в какой-либо флуоресцентной маркировке. Так же к плюсам данного метода стоит отнести низкую стоимость, мобильность (вес прибора менее 500 г) и простоту в использовании [66].
Геликазозависимый изотермический мультиплексный анализ нуклеиновых кислот (Solana) применяют для амплификации и детекции ДНК вирусов простого герпеса и вируса ветряной оспы, анализ прост в выполнении и не требует выделения нуклеиновых кислот, что снижает стоимость, временные затраты и риски возможного загрязнения образца [67, 68].
TaqMan Array Card — метод основанный на микрофлюидной технологии и одноплексной ПЦР, сконфигурированной в формате 384-луночного массива. С помощью данного метода можно одновременно протестировать образец на 21 патоген. TaqMan array card обладает рядом преимуществ перед мультиплексной ПЦР. Это связано с тем, что мультиплексная ПЦР подвержена снижению эффективности и чувствительности из-за конкуренции за реагенты ПЦР различными мишенями, специфичность может также снижаться, если тесно связанные мишени не будут выбраны и проверены тщательно [69].
Импедиметрический биосенсор для обнаружения антигена вируса герпеса опробован пока только для выявления ВПГ-1 у крупного рогатого скота, но у него есть перспективы использования для определения ВПГ у человека. Принцип биосенсора основан на спектроскопии электрохимического импеданса [70].
Представленная информация по современным направлениям развития диагностических методов для определения ИППП важна для врачей-дерматовенерологов не только для представления об основных преимуществах новых, внедряемых в практику, диагностических процедур и их отличий от уже используемых, но и показывает возможности решения основных проблем, стоящих перед лабораторной диагностикой ИППП.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.