Введение

С успешным применением мРНК-вакцин при пандемии COVID-19 их стали рассматривать как перспективные терапевтические средства различного назначения, в том числе и для лечения различных типов рака. Последнему способствует прогресс в секвенировании геномов и обработке больших данных, позволяющих быстро и точно идентифицировать специфические мутации у пораженного раком и быстро синтезировать саму мРНК-вакцину. Однако проблемой остается выбор антигена для вакцины. При существующей множественности мутаций в белках опухолей лишь малая доля мутантных пептидов (неоантигенов) может служить триггером успешной реакции иммунной системы (ИС) против опухоли. Нет общего правила для определения иммуногенности неоантигенов [1, 2].

Если попытаться оценить значимость вклада иммуногена и его платформы в эффективность и безопасность вакцины, то, не умаляя роль платформы в реализации активности иммуногена, несомненно то, что в первую очередь решается задача выбора самого иммуногена, и лишь потом к нему разрабатывается соответствующая платформа. Изобретательность по части платформ вакцин по своему характеру является биотехнологической. Выявление же «правильного» иммуногена опирается на фундаментальные основы иммунологии и представляется очень сложной проблемой.

В попытках управлять иммунитетом нельзя игнорировать проницательную мысль Ф. Крика по поводу сложности мозга: «Биолог должен руководствоваться хорошим рабочим правилом, что эволюция гораздо умнее его» [3], напоминающую о том, что функционирование человеческого мозга окутано глубокой тайной. Структурно-функциональная организация ИС не менее сложнее нервной системы, и наши возможности заблуждаться относительно ее механизмов безграничны. Частичный успех, достигнутый при лечении рака путем блокирования ключевых точек ИС, обернулся серьезными осложнениями [4, 5].

Следует признать ограниченные возможности ИС и строить наши проекты с учетом того, что, возможно, проблема трудностей борьбы с раком обусловлена не столько неполнотой наших знаний об ИС, сколько необходимостью введения в иммунологию таких фундаментальных физических понятий, как сложность, необратимость и невозможность оценивания с их помощью разрешимость проблемы. Природа порождает патологические состояния и реакции на них ИС различной сложности, и некоторые из них, возможно, следует признать как неизбежную угрозу для человечества, помня слова математика Р. Тома (R. Thom): «Познание не обязательно будет обещанием успеха или выживания: оно может вести также к уверенности в нашем поражении, в нашем конце» [6]. Попытки переступить границы возможного в наших поисках обречены на неудачу. Поэтому цель данной публикации — проанализировать некоторые проблемы и коллизии с мРНК-вакцинами против рака и возможности прогнозирования их в практике.

мРНК-вакцины

Против рака мРНК-вакцины перспективны прежде всего в аспекте преодоления проблем с гетерогенностью генетических мутаций среди пациентов посредством использования персонализированных их вариантов. Общая схема структурной организации мРНК-вакцины представлена на рис. 1, и ключевым ее элементом являются антигены опухоли пациента. Последние принято различать на антигены, ассоциированные с опухолью, и антигены, специфические для опухоли. Первые могут быть экспрессированы помимо опухоли и в других тканях и органах, но в опухолях их концентрация повышена. Их часто называют тестикулярными раковыми антигенами. Вторые экспрессируются только в соответствующих опухолях и их именуют неоантигенами. Их возникновение связано с разными молекулярными процессами, происходящими на уровне ДНК, РНК и белков. Их перечень включает как малые соматические мутации (несинонимические однонуклеотидные мутации, вставки и делеции) так и крупномасштабные генетические аберрации (новые изоформы сплайсинга, слияние генов, экспрессия транспозонов, трансляция нетранслируемой в норме последовательности, кольцевые РНК и др.). Если антигены транслируются с открытой рамки считывания, то их именуют каноническими, в противном случае — неканоническими, или криптическими [1, 2]. Идентификация антигенов опухоли представляется часто нелегкой проблемой и требует использования геномики, транскриптомики, транслятомики и иммунопептидомики с обязательным привлечением разных методов биоинформационного анализа, результаты которого предстают определяющими для дизайна вакцины.

Рис. 1. Общая схема структурной организации мРНК-вакцины.

5’UTR и 3’UTR — нетранслируемые последовательности.

Опыт применения мРНК-вакцин при пандемии COVID-19 показал ряд их несомненных достоинств: короткий цикл производства, процесс их изготовления, позволяющий избежать микробиологических загрязнений, высокая иммуногенность, возможность модифицирования для обеспечения стабильности и безопасности. Нельзя не отметить, что внедрение при пандемии мРНК-вакцин обеспечило быстрое и широкомасштабное их производство. Перспективность мРНК-вакцин связана с возможностью создания экономных (емких) поливалентных вакцин, сводя до минимума балластный антигенный груз, свойственный убитым, живым и векторным вакцинам. Они быстро деградируют и могут быть использованы в качестве платформы при создании разных вакцин.

Уроки пандемии COVID-19

Пандемия COVID-19 стала настоящим экзаменом для вакцинологии, породив около 150 вакцин. Однако ни одна из них не обеспечила длительный иммунитет к COVID-19 и не стала универсальным противодействием против новых возникающих штаммов коронавирусов. Множественность вакцин была обусловлена главным образом разнообразием использованных платформ. Вакцинация мРНК против COVID-19 не гарантировала от рисков повторного заражения коронавирусом и длительного COVID-19, но уменьшала риски смертельного исхода от инфекции и тяжелого ее течения, обеспечив вместе с другими вакцинами защиту населения от пандемии в глобальном масштабе.

Существование во всей эволюционной иерархии организмов континуума родства белков (ИКРБ) и иммуноэпитопного континуума родства (ИЭКРБ), предопределяют репертуар лимфоцитов в организме, и в нем при вакцинации могут быть недостаточно представлены лимфоциты, распознающие как «свои» иммунные эпитопы (ИЭ) вирусных белков, идентичные либо гомологичные белкам хозяина, т.е. в отношении части ИЭ вирусов ИС хозяина «ослеплена». Лишь частичная распознаваемость ИЭ вирусных белков как чужеродных объясняет феномен иммунной доминантности в аспекте способности ИС реагировать лишь на малую долю ИЭ из их большого множества. Если на «ослепляющие» ИЭ и возникает реакция ИС, например, выработкой антител, то по времени она непродолжительна, поскольку организм элиминирует сами антитела и клоны В-лимфоцитов, их синтезирующие, минимизируя риск возникновения аутоиммунного заболевания [7].

Свежим примером такой реакции ИС служит непродолжительный эффект вакцинации против коронавируса SARS-Cov2, белки которого включают в себя множество фрагментов, гомологичных множеству белков человека [8]. У переболевших же COVID-19 нередким его продолжением оказываются различные аутоиммунные заболевания в результате, по-видимому, разблокировки либо размножения клонов лимфоцитов, аутореактивных к белкам хозяина, содержащим последовательности, гомологичные белкам SARS-CoV-2. Весомой аргументацией возникновения реактивности ИС на «ослепляющие» ИЭ при COVID-19 служит концепция критериев иммуногенности [9]. В соответствии с нею для реакции ИС на антиген важны его количество, выраженные молекулярные отличия от предсуществовавшего в организме континуума антигенов и скорость возникновения новой антигенной модификации, т.е. необходимо появление в организме паттерна антигенов, который сильно отличается от того континуума антигенов, с которым рецепторы клеток ИС непрерывно взаимодействовали ранее. И инфекция, и вакцинация против инфекционного агента отвечают перечисленным критериям иммуногенности, и в этом аспекте не только сам вирус SARS-CoV-2, но и изготовленная из него или его компонентов вакцина не лишены риска индукции у прививаемых аутоиммунной реакции.

Генерация вакцин против COVID-19 строилась в основном на поиске удачи с платформой при единообразии использования носителя антигена. В полной мере стала очевидной определяющая роль антигена в структурировании специфичности иммунного ответа и вспомогательная роль платформы для антигена и способа его введения в организм. Важность роли платформы вакцины (как и пути ее введения и стабильности) в индукцию самих антител не оспорима, но особенность индуцируемого иммунного ответа в отношении свойств антител (нейтрализующих или протективных), широта их специфичности, долговременность иммунитета определена природой самого иммуногена.

Переносится ли мРНК-вакцина в геном?

Характерно, что практически во всех публикациях по мРНК-вакцинам подчеркивается, что, в отличие от ДНК-вакцин, мРНК-вакцина не проникает в ядро, что исключает возможность переноса ее в геном прививаемого. Такие утверждения находятся в противоречии с многочисленными примерами эндогенизации (глубокой рекомбинации) вирусов, геном которых представлен РНК или односпиральной ДНК, в геном хозяина или вирусов с двуспиральной ДНК [10, 11]. В аспекте эндогенизации генома (ЭГ) вирусов мРНК-вакцина для прививаемого является генетически гетерогенной и потенциально может быть интегрирована в его геном с различными последствиями. Рассмотрим подробнее проблему ЭГ вирусов в аспекте возможных рисков использования мРНК-вакцин против рака. Она аналогична рискам мРНК-вакцин против коронавирусов.

С внедрением быстрых методов секвенирования нуклеиновых кислот во всей иерархии живых организмов выявлена распространенность ЭГ вирусов в геном их хозяев [10—14]. В соответствии с временем возникновения рекомбинацию геномов можно подразделить на реликтовую, реализованную в далеком эволюционном прошлом и сохранившую свои следы, и прижизненную, реализуемую в онтогенезе хозяина. Примером последней является интеграция вируса иммунодефицита человека в геном пациента. Нередко внедренными в геном человека оказываются геномы вируса гепатита B, папилломы и полиомы [14, 15]. Примером реликтовой рекомбинации служит интеграция в геном позвоночных эндогенных ретровирусов (ЭРВ) [11].

Включение ЭРВ в геном происходило многократно в процессе эволюции млекопитающих, и доля их в геноме человека примерно 8% [11], а доля эндогенных ретроэлементов составляет, по разным оценкам, до 20—40%. ЭРВ человека (млекопитающих) — важные участники в механизмах репродукции, поддерживающие толерантность материнской ИС к плоду. Их негативные проявления связаны с инфекционными и аутоиммунными процессами, болезнями мозга и канцерогенезом [16]. Рекомбинация РНК экзогенного неретровируса и мРНК ретротранспозонов приводит к интеграции комплементарной к ней ДНК в геном [10], поэтому включение мРНК-вакцины (частично либо полностью) в геном прививаемого не представляется невозможным. Применительно к SARS-CoV-2 в условиях in vitro уже подтверждено включение его генома в геном клеток человека [17].

Уже нет сомнения относительно существования в природе генного химеризма, т.е. мозаицизма генов из фрагментов различного происхождения, и следует признать, что обмен генетической информацией между вирусами и их хозяевами был обоюдным [10, 13], но в разных масштабах. Химеризм большинства генов есть свидетельство того, что ЭГ вирусов в геном половых клеток их хозяев была в эволюции нередким событием. Вопрос остается открытым относительно частоты, стабильности и последствий ЭГ вирусов в соматические клетки хозяина на протяжении его онтогенеза.

Помимо ЭРВ выявлена и эндогенизация вирусов Эбола и Борна. Ее время возникновения не менее древнее, чем у ЭРВ, но у этих вирусов интегрированы лишь отдельные гены [14, 15]. Первые сведения об ЭГ вирусов кори, клещевого энцефалита и Синдбис в геном культуральных клеток связаны с работами В.М. Жданова и соавт. [18]. Использование ингибитора обратной транскриптазы азидотимидина предотвращало включение ДНК, комплементарной к РНК-вирусов, в геном клеток [19]. Не вдаваясь в перечисление вирусов, у которых выявлена ЭГ в геном хозяина, можно сделать обобщение, что природа перебрала все возможные варианты ЭГ вирусов в геном хозяина или в геном вирусов с другим типом нуклеиновой кислоты, и что ЭГ вирусов животных свойственна при их жизненном цикле как в цитоплазме, так и в ядре клеток.

Само многообразие вирусов и ЭГ предполагает использование природой разных механизмов генетической рекомбинации их с геномом человека, но с помощью только известных в настоящее время их моделей трудно объяснить все возможные варианты рекомбинации. Заметим только, что последствия COVID-19 сопряжены с многочисленными осложнениями, и длительность их проявления 1—2 года не является пределом, поскольку у некоторых пациентов, перенесших в тяжелой форме острый респираторный синдром в 2005 г. или средневосточный респираторный синдром в 2012 г., остаточные поражения коронавирусом наблюдались значительно дольше [20]. Добавим, что в новостях ВОЗ в начале 2024 г. отмечается глобальный рост раковых заболеваний [21]. Случаен ли этот всплеск раковых заболеваний по прошествии пандемии COVID-19 либо предстает ее следствием?

Ограниченность иммунной системы

Специфичность реакции адаптивной ИС не предопределена, а возникает в онтогенезе, формирусь в организме в результате селекциии в контексте переплетения множества механизмов. Возникает потому, что размеры генома ограничены и невозможно унаследовать в нем сколько-нибудь значительное число генов иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов. Для динамичного обеспечения ими организма наследуется не само многообразие их генов, а механизм его формирования из сравнительно небольшого числа их «заготовок» — посредством рекомбинации генов их V-, D- и J-областей, первичная структура которых варьирует в результате соматических изменений генома. Расчетные масштабы разнообразия иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов не соответствуют реальному числу лимфоцитов, образующихся в течение человеческой жизни [22], что аргументируется также ограничениями в кодировании генов [23, 24] и в составе трипептидов в первичных структурах белков.

В частности, анализ линейного распределения в мРНК кодонов позволил выявить ограничения в кодировании генов, проявляющееся в соседстве триплетов преимущественно с идентичными или близкими значениями индексов комплементарности (ИК). Последние равны общему числу комплементарных связей триплета с узнающей его тРНК [23]. Оказалось, что разница ИК между последовательно считываемыми трикодонами со сдвигом считывания на 1 кодон, как это происходит на рибосоме при трансляции мРНК, очень редко равна 3, а в 87% случаев она равна 0 или 1. Одно из следствий такого ограничения могло бы проявляться в ограничении многообразия белков путем сужения масштаба их мутагенеза, в частности при антителогенезе и формировании рецепторов Т-лимфоцитов. Оценки их многообразия, вероятно, имеют более низкие значения, что подтверждается ограниченными возможностями адаптивной иммунной системы в борьбе против инфекций. Хотя первичная структура иммуноглобулинов и рецепторов Т-лимфоцитов наиболее вариабельна в онтогенезе по сравнению с другими белками, отмеченные выше ограничения в кодировании их генов строго соблюдаются. Ограниченность ИС следует и из ограниченности соседствования кодонов в мРНК. В большой выборке мРНК разных белков не выявлен длинный ряд дикодонов, а другие дикодоны встречаются очень редко [24].

Особенно явно ограниченность в многообразии антител и рецепторов Т-лимфоцитов следует из данных по анализу встречаемости трипептидов в белках. Поскольку важным фактором, определяющим частоту встречаемости трипептидов в белке, является его длина, то для зондирования наличия ограничений был исследован массив из 54 белков (с общей их протяженностью в 114 033 аминокислот), в состав которого входили преимущественно длинные белки, в том числе и титин как наиболее длинный из человеческих белков. В белках этого массива не было выявлено 297 разных трипептидов (рис. 2), а численность трипептидов, встречавшихся только 1, 2 и 3 раза (далее они будут именоваться как редкие трипептиды), составляла соответственно 430, 436 и 500. В числе невыявленных трипептидов преобладают комбинации из редких аминокислот, особенно метионина, гистидина, цистеина и триптофана (см. рис. 2), а среди редко встречающихся трипептидов — комбинации аминокислот с разной частотой встречаемости в белках. Суммарная доля приведенных четырех показателей, отражающих частоту не выявленных и редко встречающихся трипептидов, составляет 20,8% от 8000 возможного числа разных трипептидотов и несомненно свидетельствует о существовании ограничений в первичных структурах белков. Оно распространяется и на титин, длина которого составляет 35 991 аминокислот и значительно превышает общее количества возможных трипептидов — 8000. По сравнению с титином длина вариабельных областей иммуноглобулинов, примерно в 112 аминокислот, представляется мизерной, и вероятность существования значительных органичений в их первичной структуре очень высока. Ограничения в кодировании генов и на уровне первичных структур белков могут оказаться трудно преодолимыми барьерами в поисках вакцин и одним из возможных объяснений бессилия ИС против многих инфекций.

Рис. 2. Трипептиды, не выявленные в белках человека.

Примечание. В статье используется международный код аминокислот: A — аланин, C — цистеин, D — аспарагиновая кислота, E — глутаминовая кислота, F — фенилаланин, G — глицин, H — гистидин, I — изолейцин, K — лизин, L — лейцин, M — метионин, N — аспарагин, P — пролин, Q — глутамин, R — аргинин, S — серин, T — треонин, V — валин, W — триптофан, Y — тирозин. Для обозначения нуклеиновых оснований используется следующая аббревиатура: А — аденин, G — гуанин, C — цитозин, Т — тимин.

Ограниченность ИС проявляется и в том, что иммунному узнаванию не свойственна строгая специфичность. Вырожденность иммунного узнавания проявляется в том, что любой ИЭ может быть распознан разными Т-клеточными рецепторами, и, следовательно, активировать множество клонов-лимфоцитов, т.е. иммунное узнавание является поликлональным. С другой стороны, множество различных ИЭ способен распознавать любой клон лимфоцитов, что можно было бы определить это как полиузнавание [25]. Еще 30 лет назад было признано, что и моноклональные антитела всегда полиспецифичные [26]. Процесс иммунного узнавания не сводится лишь к контакту комплекса МНС-иммунный эпитоп с T-клеточным рецептором, а является результатом коллективного взаимодействия разных клеток, ибо ключевым моментом являются последствия этого контакта. А они неоднозначны и характеризуются вовлечением множества разных процессов, и каждый из них обусловливается множеством факторов. Само взаимодействие комплекса МНС-эпитоп с T-клеточным рецептором является лишь триггером последующей, уже предуготовленной цепи молекулярно-клеточных событий, определяемой состоянием самих участников иммунного узнавания, средой, в которой оно происходит, и составом и состоянием других участников эффекторного ответа ИС. Все это характеризует ИС как систему с континуумом состояний дифференциаций и линий (популяций, клонов) клеток. В нем каждая клетка проявляет в данный момент ее жизненного цикла слегка уникальный паттерн характеристик, реализуемых ее геномом [3]. При поликлональности и полиузнавании в ИС опасность мРНК-вакцин с многочисленными неоантигенами может быть связана с риском индукции аутоиммунных нарушений с медленным отсроченным проявлением.

При множестве механизмов канцерогенеза не все они подвластны надзору со стороны ИС. Если в случае возникновения неоантигенов реакция ИС на них очень ограничена и активация ее посредством персонализированных вакцин, в частности мРНК-вакцин, представляется возможной, то при эпигенетических изменениях, индуцирующих возникновение опухоли, практически все составляющие опухоль белки являются нормальными и она воспринимается ИС как «свое». Возникновение эпигенетических изменений может быть связано с влиянием компонентов инфекционных агентов, реорганизующих структуру хромосом. Так, вирусные белки потенциально могут, взаимодействуя комплементарно с белками хромосом, разворачивать в них петли и дерепрессировать гены ранних стадий онтогенеза организма, индуцируя неконтролируемую пролиферацию клеток с экспрессией множества белков, классифицируемых как ассоциированные с опухолью антигены и наделенных изначально иммунной толерантностью. Предпосылкой для аргументации возможности реализации такого механизма онкогенеза могла бы быть гомология между белками инфекционного агента и белками, обеспечивающими поддержание структуры хромосом человека.

В связи с упомянутым всплеском раковых заболеваний во время и после пандемии COVID-19 нами был выполнен компьютерный поиск гомологичных пептидов между спайковым (S), мембранным (M), малым мембранным (E) белками и нуклеопротеином (N) референсного пандемического штамма коронавируса SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 и 63 белками человека, обеспечивающими поддержание структуры хромосом. Последние включали 11 конденсинов, 45 когезинов и 8 SMC (structural maintenance of chromosomes)5/6 белков. Анализ выявил в структурных белках коронавируса SARS-CoV-2 большое множество пептидов, гомологичных белкам, обеспечивающим поддержание структуры хромосом человека (рис. 3). На рис. 3 приведен лишь фрагмент списка большого числа гомологичных фрагментов. Наибольшее количество их, как и степень гомологии с разными белками, приходится на S и N белки вируса SARS-CoV-2. Из-за меньших размеров репертуар гомологичных пептидов у белков M и E SARS-CoV-2 намного скромнее, чем у S-белка.

Рис. 3. Пары гомологичных пептидов структурных белков пандемического коронавируса и белков, обеспечивающих поддержание структуры хромосом человека.

Названия белков приводятся по международной аббревиатуре их генов (www.nextprot.org).

На рис. 4 схематически проиллюстрирована возможность комплементарного взаимодействия белка 1, обеспечивающего поддержание структуры хромосом человека, с вирусным белком 2, содержащим последовательность, гомологичную белку 3, комплементарно взаимодействующую с белком 1. Этот сценарий онкогенеза не требует встраивания генома вируса в геном хозяина и постоянного присутствия вируса в организме; в минимальном варианте для формирования опухоли как единственного следа минувшей инфекции достаточно запустить необратимую пролиферацию в одной клетке. Заметим, что и структурные белки вирусов гриппа, и вирусов папилломы человека также содержат последовательности, гомологичные белкам, обеспечивающим поддержание структуры хромосом человека, но у коронавируса таких последовательностей больше и выше степень их гомологичности. То, что в большинстве случаев опухоли успешно преодолевают надзор ИС, служит аргументом в пользу предположения о ведущей роли в онкогенезе эпигенетических изменений.

Рис. 4. Схема взаимодействия гомологичной последовательности в разных белках с комплементарной последовательностью в другом белке.

Коллизии с неоантигенами

Ключевым моментом успеха в применении иммунотерапии является мутационный груз опухоли, и чем он больше, тем большая вероятность в подавлении опухоли иммунотерапией. Однако у большинства опухолей мутационный груз варьирует от малого до умеренного. Но даже и при числе обнаруженных мутациий в опухоли более 1000 связывание с главным комплексом гистосовместимости (МНС) и, соответственно, проявление иммуногенности связано лишь с 5—6% из них [1]. Можно указать на несколько факторов, которые могли бы обусловливать низкую иммуногенность неоантигенов.

Согласно упомянутой концепции возникновения иммуногенности [9], обладание иммуногенностью мутировавшими белками опухоли должно быть заблокированным, поскольку возникновение неоантигена в организме является хотя и внезапным, но возрастание его концентрации, зависящее от роста опухоли, — процесс медленный и поэтому сопряжен с возникновением к ней иммунной толерантности, аналогично тому, как это происходит в процессе беременности. К тому же даже криптические белки, как будет показано ниже, гомологичны многим белками хозяина.

Вторым фактором может служить недостаточность репертуара лимфоцитов в организме, обусловленная ограничениями в кодировании генов и разнообразии первичных структур белков, в том числе и рецепторов T-лимфоцитов. Опухоли в большинстве случаев — спутники стареющего организма, с его увяданием сложной системы саморегуляции и восполнения утрачиваемых клеток и накоплением патологических изменений, резко отличают его от организма в молодом возрасте. Процесс специфического иммунного узнавания и последующий за ним ответ ИС связаны с коллективным взаимодействием разных клеток и не являются однозначными, завися от контекста той среды, в которой они протекают [27].

В качестве третьего фактора, определяющего потенциальные границы возможностей адаптивной ИС реагировать на вакцину и позволяющего прогнозирование связанных с нею рисков, можно рассматривать существование ПКРБ и частного его проявления — ИЭКРБ [7]. Иммунные эпитопы (ИЭ) не являются каким-то обособленным подмножеством пептидных фрагментов белков, и их рассеянность и повторяемость в разных белках лишь отражает особенности возникновения и эволюции белков. Опишем кратко суть ПКРБ.

Концепция ПКРБ основывается на том, что первичные структуры белков различных организмов, включая и вирусы, обнаруживают блочное родство, то есть их последовательности родственны не по всей длине, а лишь по отдельным протяженным блокам, причем разветвленная сеть блочного родства охватывает белки, глубоко различающиеся по своим функциям [7]. Граф на рис. 5 представляет схематично фрагмент ПКРБ (или ИЭКРБ). Узлами (точки на графе) в нем являются сами белки, а ребра, соединяющие узлы графа, указывают на наличие у них родственных пептидов (или ИЭ). Числовые значения N над ребрами (на рис. 3 в качестве примера условно показаны N только на двух ребрах) — число таких родственных пептидов у соответствующей пары белков. Представление ПКРБ в виде математического объекта в компьютерном исполнении наглядно и помогает прогнозировать сложную сеть перекрестных реакций антител.

Рис. 5. Схематичное представление иммуноэпитопного континуума родства белков в виде графа [7].

Для конкретного обоснования полезности концепции ПКРБ и ИЭКРБ применительно к проектированию мРНК-вакцин против рака обратимся к данным исследования эффектов персональных неоантигенных вакцин против меланомы [28]. В этом исследовании пациентам с меланомой вводили персональные вакцины, содержавшие до 20 неоантигенов, возникших в результате соматических мутаций. Нами выполнен анализ родства этих неоантигенов с другими белками человека, использовав для этого базу из около 11000 белков. На рис. 6 в качестве примера приводятся данные по гомологии неоантигенов SGSPPLRVSVGDFSQEFSPIQEAQQD (р26) и PGKIHLFEAEFTQVAKKE (р18), кодируемых соответственно генами RUSC2 и ARHGAP29, с другими белками человека. (Гомологию определяли при сдвиге рамки считывания длиною в 12 аминокислот, учитывая число идентичных позиций у пептидов). Как более длинный, первый пептид обнаруживал высокую гомологию (8—9 идентичных позиций из 12) с большим числом пептидов из разных генов, и оба пептида обнаруживали родство со многими пептидами из белков, кодируемыми разными генами, при уровне идентичности менее 8. Гомологичность неоантигенов другим белкам организма связана с риском возникновения аутоиммунной реакции как в случае пептидных вакцин, так и мРНК-вакцин.

Рис. 6. Пары гомологичных последовательностей между неоантигенами (р26 и р28) меланомы и белками человека.

Здесь и в рис. 7: приводится международная сигнатура генов белков.

Не застрахованы от этого риска и мРНК-вакцины, кодируюшие неоантигены, возникшие в результате сдвига рамки считывания как в случае малых соматических мутаций, так и крупномасштабных генетических аберраций. Для иллюстрации мы воспользовались геном сывороточного альбумина человека, транслируя его in silico со сдвигом рамки считывания на 1 нуклеотид. Продуктами трансляции оказались как короткие, так и длинные пептиды. Наибольший из них длиною в 83 аминокислоты (р83) был подвергнут анализу на гомологичность нормальным белкам человека. Оказалось, что пептид р83 проявляет гомологию с 563 из 11000 белков в имеющей у автора базы данных. На рис. 7 приведены пары гомологичных пептидов с уровнем идентичности, равным 8 и 9, среди которых и пары с длинными (в 6—7 аминокислот) непрерывающимися блоками идентичных позиций. При такой множественности гомологии неоантигенов с разными белками организма удивительна ли упомянутая выше низкая иммуногенность неоантигенов и избегание опухолями надзора иммунной системы?

Рис. 7. Пары гомологичных последовательностей между пептидом р83 и белками человека.

Следует быть осторожным с выбором неоантигенов, включаемых в состав мРНК-вакцины, поскольку среди них могут быть неоантигены с иммуносупрессивными свойствами, посредством которых опухоль избегает ИС. В упомянутом выше исследовании эффектов персональных неоантигенных вакцин против меланомы [28] среди 30 использованных пептидов, которыми лечили пациентов, 2 пептида — TKRQVILLHTELERFLEYLPLRF (ген DCAKD) и ERFWRNILLLSLHKGSLYPRIPGLGKE (ген CASP1) — возможно, обладают иммуносупрессорной активностью, поскольку содержат ранее описанные A.B. Sigalov [29] имуносупрессорные домены, частые спутники вирусных белков и состоящие обязательно из блока гидрофобных аминокислот, фланкированного положительно заряженными аминокислотами.

Выявленный феномен гомологии криптических пептидов (неоантигенов) с белками, считываемыми с канонических рамок считывания, подводят к выводу, что криптические пептиды отображены в описанных ранее в ПКРБ и ИЭКРБ и обречены на слабую узнаваемость их ИС. С ними связаны риски возникновения паранеопластических синдромов при раке, а также при терапии мРНК-вакцинами против рака. Классическим примером паранеопластического синдрома служит паранеопластическая нейродегенерация, проявляющаяся неврологическими нарушениями у пациентов со злокачественными опухолями (чаще всего при раке молочной железы и яичников, мелкоклеточном раке легких) и обусловленная эффективным естественным противоопухолевым иммунным ответом против антигенов раковых клеток, которые в норме экспрессируются исключительно в мозгу. Их обозначают как онконейральные антигены. Индуцированный онконейральными антигенами естественный иммунный ответ нередко супрессирует рост самой опухоли, в которой они экспрессировались. Успешный иммунный ответ и сама опухоль не были бы замечены, если бы иммунные клетки, первоначально распознающие онконейральные антигены в опухоли, не проникали бы в мозг, вызывая аутоиммунное повреждение нейронов, экспрессирующих те же антигены, что и возникшая опухоль, и соответствующую неврологическую симптоматику [30, 31].

Следовательно, при дизайне мРНК-вакцины против рака с определенным составом неоантигенов обязательным этапом должен быть анализ гомологии неоантигенов с другими белками (особенно с белками мозга), составляющими протеом человека, и исключение неоантигенов, потенциально способных обладать иммуносупрессорной активностью. В мозгу, по сравнению с другими органами, экспрессируется самое большое количество белков, и многие из них не вовлечены в центральные механизмы иммунной толерантности, реализуемых в тимусе. Выбор конкретного неоантигена как потенциального кандидата для включения в мРНК-вакцину против рака уже на самых ранних этапах дизайна должен быть обоснован хотя бы тем, что он не охвачен ИЭКРБ.

Поможет снизить риски неудач с мРНК-вакцинами против рака сравнение состава трипептидов неоантигенов с составом трипептидов белков человека и патогенных для него вирусов. Почему именно трипептиды? Трипептиды (в отличие от дипептидов) являются минимальными специфичными последовательностями, встречаемость которых в белках уже ограничена, и они в структуре ИЭ соучаствуют в иммунном узнавании. T-клетки адаптивной ИС распознают «своего» и «не своего» через сканирование презентируемых им главными комплексами гистосовместимости (МНС) фрагментов белков — ИЭ. Первоначально в антиген-презентирующих клетках ИЭ связывается с двумя разными молекулами, составляющими МНС, а затем распознается двумя разными молекулами рецептора T-клеток. В минимальном варианте комплексирование ИЭ с МНС, по-видимому, требует трех его контактов с МНС (по обоим концам и центральной части ИЭ). Для распознавания ИЭ двумя молекулами рецептора T-клетки необходимы еще два контакта. При длине ИЭ, связывающегося с МНС класса I (МНС I), в 9 аминокислот, и длине ИЭ, комплексирующегося с МНС класса II (МНС II), в 15 аминокислот очевидно, что каждый из 5 контактов при иммунном распознавании опосредуется участием 1—2 аминокислот ИЭ, рестриктированного МНС I, и 2—3 аминокислотами в случае ИЭ, рестриктированного МНС II, т.е. в обоих комплексах МНС-ИЭ-T-клеточный рецептор в контакты вовлечена вся первичная структура ИЭ. Узнавание между компонентами комплексов по ди- и трипептидам является экономным (природа не роскошествует) и достаточным, обеспечивая динамичность (обратимость) процесса через слабую аффинность взаимодействий компонентов.

Не выявляемые или редко встречающиеся в белках человека и вирусов трипептиды, можно рассматривать как возможные маркеры иммуногенности неоантигена. Для избегания ИС хозяина вирусы используют, по крайней мере, две стратегии. Первая связана с блокированием на разных уровнях активности ИС, и каждый вирус обладает для этого своим специфическим механизмом. Вторая стратегия универсальна для вирусов и реализуются частичной молекулярной мимикрией белков их хозяина и исключением в структуре своих белков последовательностей, распознаваемых аутотолерантной ИС хозяина. Применительно к неоантигенам исключаемые из первичных структур белков человека и патогенных для него вирусов трипептиды, как и редко встречающиеся, можно принять за запретные для нормальных белков и отображающие репертуар множества циркулирующих в организме аутотолерантных клеток ИС.

При неисчерпаемой изощренности природы по части сотворения многообразия вирусов трипептидный состав их белков, оказывается, ограничен в большей степени, чем белки человека. Предпринятый нами компьютерный анализ первичных структур 113 поверхностных белков 60 вирусов из разных семейств и родов, общая протяженность которых составляет 58709 аминокислот, выявил, что в них отсутствуют 579 из 8000 возможных трипептидов. В совокупности в вирусных белках доля не выявленных и редких трипептидов от общего числа возможных составляла 27%. Примечательно то, что среди не выявленных трипептидов у человека (их 297) и у вирусов (их 579) общими оказались лишь 112 трипептидов. Эти сильные различия обусловлены, вероятно, как использованием для анализа вирусов меньшей общей протяженности их белков, по сравнению с человеческими белками (см. раздел «Ограниченность иммунной системы»), так и ограниченной длиной самих поверхностных белков вирусов. Но это не снижает полезность сравнения состава трипептидов неоантигенов с составом не выявленных и редких трипептидов поверхностных белков вирусов, поскольку поверхностные белки вирусов первыми при инфекции организма подвергаются надзору ИС хозяина и должны «ослеплять» ИС. Возможна и другая трактовка высокой доли не выявленных и редко встречающихся трипептидов у вирусных белков. Если применительно к белкам хозяина аутотолерантность ИС формируется ее центральными и периферическими механизмами путем элиминации из организма аутореактивных лимфоцитов либо подавлением их активности, то в вирусных белках должны быть исключены не только последовательности, не выявленные или редко встречающиеся в белках хозяина, но и последовательности, распознаваемые МНС I, МНС II и циркулирующим в организме множеством аутолерантных T-клеток. В этом аспекте особенности состава трипептидов белков вирусов, патогенных для человека, могут служить индикатором потенциала реактивности циркулирующих в организме хозяина аутотолерантных T-клеток на неоантиген или биомаркерами для прогнозирования иммуногенности последнего. Тестирование выше упомянутых пептидов р26 и р18 позволило выявить в них редко встречающиеся в вирусных белках трипептиды, что поволяет прогнозировать наличие у обоих пептидов иммуногенности. Однако в этих же пептидах не обнаружены даже редкие трипептиды белков человека, что свидетельствует о большей чувствительности первого теста и позволяет рекомендовать его для поиска потенциально иммуногенных неоантигенов.

Анализируя коллизии с криптическими пептидами (неоантигенами), нельзя не заметить, что природа их происхождения не ограничена возникновением рака. Процесс синтеза белка является очень затратным: у млекопитающих поиск рибосомами стартового кодона в открытой рамке считывания сопряжен с беспорядочной трансляцией мРНК, продуктами которой являются криптические пептиды различной длины. Они могут составлять до 15% иммунопептидома [1]. Следовательно, сама природа синтеза белка изначально ослепляет ИС в аспекте различения как «своего» и « несвоего» в неоантигенах, возникающих при раке, и с любой мРНК-вакциной транслируемые с нее криптические пептиды предстают для исследователя как «темная материя», порождая неопределенность в отношении эффективности мРНК-вакцины.

Иммунодоминантность и иммунная память

Известно, что опухоли с малым мутационным грузом плохо поддаются иммунотерапии, и кажется оправданным вакцинирование пациента высокими дозами неоантигена, согласующееся с одним из критериев иммуногенности [9]. Однако природа свидетельствует о том, что важным оказывается не столько концентрация неоантигена, сколько наличие у него иммунодоминантности. В этой связи обратимся к вирусу гриппа (табл. 1) и коронавирусу SARS-CoV-2.

Таблица 1. Показатели иммунодоминантности белков вируса гриппа A [32]

Из приведенных данных в табл. 1 следует отсутствие линейной связи иммунодоминантности с числом структурных белков, приходящихся на вирион. Гемагглютинин, не являясь самым многочисленным в структуре вириона вируса гриппа, предстает иммунодоминантным. В случае белков коронавируса SARS-CoV-2 контраст по иммунодоминантности еще больший. Доля S-белка относительно к M-белку у коронавируса значительно ниже, чем гемагглютинина к M1-белку в вирионе вируса гриппа. Но именно иммунодоминантность S-белка коронавируса SARS-CoV-2 предопределила выбор его в качестве вакцины.

Естественно, возникает вопрос относительно биомаркеров иммунодоминантности в белках. В гемагглютинине и S-белке иммунодоминантными являются, соответственно, их фрагменты HA1 и S1. При принадлежности HA и S-белка совершенно разным вирусам сопоставление особенностей их первичных структур кажется некорректным. К тому же молекулярные механизмы их эволюции разные. Однако возможно предпринять их сравнение на низшем уровне характеристик белков, например, на уровне количественных изменений в аминокислотном составе и дипептидов.

Оказалось, что как HA1 отличается от HA2, так и S1 резко отличается от S2 по содержанию тех аминокислот, которые характерны для внутренне дезорганизованных областей и петель белков. К таковым, как известно, относятся полярные аминокислоты (глутамин, аспарагин, глицин, серин и пролин). Обогащенность ими HA1 и S1 предопределяет наличие в них областей с «вытянутой » конформацией, потенциально способных быть доминантными ИЭ, поскольку их «вытянутая» конформация наиболее конгруэнтна полости в МНС I и МНС II. Самые первые методы оценки иммуногенности белков свидетельствовали о том, что в иммунных эпитопах доля гидрофобных аминокислот гораздо меньше гидрофильных. Для аминокислотного состава субъединиц HA1 и S1 характерно и высокое содержание положительно заряженных аминокислот. Последние предопределяют тенденцию созревания B-клеток в герминативных центрах увеличением их аффинности. Лизин и аргинин, например, формируют при взаимодействии белков ионные связи, превосходящие по своей силе другие связи. При наличии в структуре ИЭ аргинина и лизина созревание рецептора B-клеток в герминативных центрах должно реализоваться (как результат соматических гипермутаций) появлением в рецепторе (топологически комплементарно ) другого партнера ионной связи — дикарбоновых аминокислот. Поэтому присутствие полярных и заряженных аминокислот в структуре ИЭ можно рассматривать как маркер иммунодоминантности.

Придание мРНК-вакцине против рака способность вызывать в организме пациента долговременный иммунитет к первичной опухоли является важным элементом в ее дизайне, так как клинические наблюдения и экспериментальные модели показали, что наряду с первичной опухолью в организме сосуществует множество циркулирующих и диссеминированных в органах-мишенях клеток раковой опухоли, обусловливающих возникновение после различной продолжительности раковой спячки клинически явных метастазов. Памятуя, что мРНК-вакцина на основе S-белка коронавируса SARS-CoV-2 не формировала долговременный иммунитет и не гарантировала вакцинированному повторное заражение коронавирусом, а индуцированные ею антитела быстро выводились из организма, то следует признать, что биомаркеры иммунодоминантности являются необходимыми, но недостаточными в качестве биомаркеров ИЭ, формирующих долговременную иммунную память. Для выявления последних полезным источником информации могут служить особенности белков вирусов, вакцины из которых либо инфекция ими формируют пожизненно долговременную иммунную память. Таковыми являются известные вакцины против кори, краснухи, паротита и полиомиелита и др., и аминокислотные составы их поверхностных белков приведены в табл. 2. Высокая заразность этих вирусов, с одной стороны, и прочность вызываемого ими пожизненного иммунитета, — с другой стороны, служат основанием рассматривать их ИЭ как универсальные эталоны при идентификации сходных с ними ИЭ в других белках. Представленность их разными вирусами с резко отличающимися по нуклеотидному составу геномами и, соответственно, различными первичными структурами их белков позволяет считать, что составляющие их белки ИЭ рестриктированы по множеству гаплотипов МНС I и МНС II.

Таблица 2. Аминокислотный состав поверхностных белков вирусов человека

Примечание. (L) — длина белков по количеству аминокислот.

Обращает внимание то, что в белках вирусов, вызывающих долговременный иммунитет, кроме повышенного содержания аминокислот, свойственных для внутренне дезорганизованных областей и петель белков, повышено и относительное содержание пролина. Единственным исключением в списке является E-белок вируса желтой лихорадки. Возможным объяснением служит то, что для долговременного иммунитета достаточно повышенного содержания пролина локально в протяженной области белка, что и характерно для E-белка вируса желтой лихорадки.

Известно, что пролин избегает вторичные структуры в белках, сосредоточиваясь преимущественно в их внутренне дезорганизованных областях, что предполагает вытянутую структуру ИЭ, индуцирующих долговременную иммунную память. Кроме того, в белках вирусов пролин обеспечивает, по-видимому, более длительное время полужизни содержщих его ИЭ, защищая их от атак трипсиноподобных протеаз. В поверхностных белках вирусов, к которым индуцируется долговременный иммунитет, высока доля дипептидов из лизина, аргинина и пролина. Соседство пролина с лизином или аргинином с карбоксильного конца, как известно, существенно препятствует активности трипсина [33], обеспечивая тем самым ИЭ большую метаболическую стабильность и время жизни.

Приведенные биомаркеры иммуногенности ИЭ могут быть полезными при выборе неоантигена для включения его в состав мРНК-вакцины. Дополнительной информацией при оценке потенциала иммуногенности неоантигена могла бы быть степень сходства состава его дипептидов и трипептидов с таковыми белков вирусов, инфекция которыми либо вакцинация против них вызывает пожизненный иммунитет. Конструирование персонализированных мРНК-вакцины против рака нередко основывается на включении в нее множества (до нескольких десятков) неоантигенов, что может создавать конкуренцию между ними за иммунодоминантность и быть перегрузкой для ИС. При естественной инфекции вирусом гриппа в гемагглютинине H1 лишь не более 5 сайтов оказываются иммуногенными.

Заключение

Рассмотренные особенности проблем и коллизии мРНК-вакцин против рака дополняют анализ общих проблем вакцинологии [34]. Коллизии с неоантигенами не исчерпываются слабой реакцией на них ИС как «не свое», так как онкогенез индуцируется не только мутациями, но и эпигенетическими изменениями в клетках, возникающими спонтанно либо под влиянием внешних и внутренних факторов. Не будет преувеличением утверждение, что рак в той же степени эпигенетическая болезнь, как и генетическая. Эпигенетические изменения способны индуцировать активацию онкогенов и выключение генов, супрессирующих опухоль. ИС может вовсе не замечать их, кроме случаев, когда экспрессируются белки, аутотолерантность к которым в организме не обеспечена, например к онконейрональным антигенам [35].

Широкое использование мРНК-вакцин в качестве средства иммунотерапии уже неотвратимо, и мы в ожидании оценок результатов испытаний их при различных формах рака. Применение персонализированных мРНК-вакцин в качестве адъювантной терапии для предотвращения рецидивов после хирургического удаления опухоли (меланома, рак поджелудочной железы) вселяет оптимизм [36, 37], как и подход идентификации иммуногенности неоантигенов по реакции на них T-клеток пациента [38], но следует реально прогнозировать границы применения мРНК-вакцин в онкологии. Априорно ясно, что ограничением в использовании мРНК-вакцин являются запущенные формы рака. Вполне возможно, что при расположении опухоли в иммунопривилегированных органах шансы на успех от вакцинации будут невелики. Не преодолеть вакцинацией и эпигенетические изменения в опухоли. Описанный в данном сообщении феномен гомологии неоантигенов со множеством разных белков служит предостережением в выборе их для включения в состав мРНК-вакцины.

Важной проблемой в использовании мРНК-вакцин против рака является обеспечение ими долговременного иммунитета, способного нейтрализовать активированные, вышедшие из раковой спячки диссеминированные микрометастазы, столь характерные, например, для рака молочной железы.

В числе отличительных характеристик злокачественных опухолей — избегание ими иммунного надзора. Иммунной системе свойственен дуализм, поскольку она способна как реализовывать благоприятные для организма аутоиммунные реакции и избегать повреждающих аутоиммунных атак, так и не функционировать деструктивно против сосуществующих в организме функционально необходимых для него чужеродных клеток и антигенных субстратов. Но как «свой», так и «не свой» может оказаться ею атакованным. При канцерогенезе одни и те же процессы могут по-разному проявлять себя в разных обстоятельствах.

Участники иммуносупрессивных стратегий, как и способы избегания опухолями ИС, удивительно разнообразны. Рак как возникшая новая мини-система в организме служит примером патологического использованием им множества механизмов супрессии и избегания ИС. Из многообразия их следуют невозможность и ненадежность противостоять онкогенезу моноиммунотерапией. Иммунотерапия должна быть синергичной с другими видами терапии и предполагать не только запуск гибели опухолевых клеток, но и изменение микроокружения опухолевых клеток, уменьшение толерогенных механизмов и стимулирование ИС. Лучшая стратегия при лечении рака — мультифакторная терапия [35], мРНК-вакцины можно комбинировать с другими видами иммунотерапии. Перспективность мРНК-вакцин заключается и в возможностях их совершенствования, в частности, в том, что в них могут быть представлены, помимо неоантигенов опухоли, компоненты, нацеленные на подавление различных процессов канцерогенеза.

Финансирование. Статья выполнена по госзаданию на 2024 год: ГЗ № 075-00264-24-00.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Посвящается памяти И.П. Ашмарина