Гетероплазменные мутации — термин, используемый для описания смеси двух или более разных митохондриальных генома в одной клетке. Отношение количества митохондриальной ДНК (мтДНК) дикого типа к количеству мутантной называется степенью гетероплазмии и определяет тяжесть заболевания.

Гомоплазменные мутации — все копии митохондриального генома мутантны. Заболевание передается всему потомству.

Донор мтДНК — пациет или особь (животное) с мтДНК дикого типа.

Кариопласт — веретено деления клетки или ядро, наряду с небольшим количеством цитоплазмы, заключенные в клеточную мембрану; формируется для переноса ядерного генома реципиента во время энуклеации.

Митохондриальный перенос — мутантные митохондрии и, как следствие, мтДНК, которые переносятся вместе с кариопластом во время переноса ядерного генома (терапия митохондриальных заболеваний). Количество мтДНК является функцией от количества цитоплазмы и плотности митохондрий в районе веретена деления или пронуклеарном регионе.

Несоответствие мтДНК — патологическое взаимодействие между донорской митохондриальной ДНК и мтДНК реципиента после переноса ядерного генома из-за различий в последовательностях ДНК. Возникает в результате митохондриального переноса.

Реципиент мтДНК — пациент или особь (животное) с мутантной мтДНК и признаками заболевания.

Цитопласт — клеточная мембрана с цитоплазмой, за исключением ядра, сформированная после энуклеации клеток или процедуры удаления веретена деления.

Дефекты функционального состояния митохондрий все чаще обсуждаются в литературе [1], являясь причиной многих тяжелых заболеваний, поражающих различные органы и ткани. Митохондрии находятся под генетическим контролем как ядерного, так и митохондриального генома, результатом дефектов одного из которых является митохондриальная дисфункция. Многие взрослые и дети с митохондриальными заболеваниями являются носителями наследуемых дефектов митохондриального генома, по меньшей мере, 1 из 8500 индивидуумов в популяции является носителем мтДНК. Это означает, что не менее 1/3 женщин репродуктивного возраста являются носителями мутаций мтДНК [2].

Дефекты мтДНК были впервые описаны в 1988 г. С тех пор методы диагностики митохондриальных заболеваний улучшились, но все еще существует немало ограничений в лечении данных расстройств [3, 4]. мтДНК кодирует 13 основных субъединиц дыхательной цепи, а также 24 молекулы РНК, необходимые для внутримитохондриального синтеза белка [4]. Митохондриальный геном присутствует во множестве копий в клетке. У здоровых лиц все его копии являются идентичными — гомоплазменными [1, 4]. У пациентов с генетическими дефектами мутации могут присутствовать во всех копиях генома (гомоплазменные мутации) или только в некоторых экземплярах (гетероплазменные мутации). В связи с трудностями в лечении митохондриальных болезней приоритетом является обеспечение семей сответствующим генетическим консультированием, а также разработка способов предотвращения передачи этих болезней [1, 5].

Клинически митохондриальные заболевания очень разнообразны и встречаются у пациентов всех возрастных групп. Пациенты обращаются к врачам широкого диапазона специальностей. Мутации мтДНК связаны с серьезными расстройствами, такими как миопатии, нейродегенеративные заболевания, болезни кроветворения, сахарный диабет, рак и бесплодие [3, 5]. Примерами таких заболеваний являются: прогрессирующая офтальмоплегия, синдром Пирсона (панцитопения, инсулинозависимый сахарный диабет), оптическая невропатия Лебера, синдром Лея (подострая некротизирующая энцефалопатия), различные типы миодистрофий и миостений, острый некроз скелетных мышц (рабдомиолиз), а также аминогликозидиндуцированная потеря слуха и другие нейродегенеративные заболевания. Кроме того, исследования на животных и у людей показывают, что мутации мтДНК и митохондриальная дисфункция вовлечены в патогенез возрастных изменений и заболеваний, таких как сахарный диабет, болезнь Альцгеймера, болезни Паркинсона и Хантингтона [5].

Настоящий обзор литературы освещает аспекты текущей клинической практики и будущих возможностей в рамках ВРТ для предотвращения передачи мутаций мтДНК. В том числе использование новых технологий микроманипуляции с пронуклеусами зигот, переноса веретена деления и полярного тела между эмбрионами: современные подходы, которые, как было показано, были успешно реализованы на животных.

мтДНК наследуется по материнской линии. Семейные исследования показали, что мутации могут возникать спонтанно или могут быть унаследованы, затрагивая многих членов семьи [1, 6]. Мутации широко варьируют по рискам передачи, например, одиночные делеции мтДНК часто носят спорадический характер, в то время как другие передаются с высокой степенью вероятности [5]. Выявление специфических мутаций и обследование всех членов семьи могут быть полезны при определении вероятности передачи заболевания потомству [7]. Детальные исследования в больших когортах пациентов также дают ценную информацию о риске передачи. Например, анализ 226 семей, в которых делеции в генах мтДНК были определены у пробанда, показал, что риск рецидива в потомстве больной матери равен 4—11%. Если у матери нет клинических симптомов, а также нет никаких сведений о пострадавших братьях и сестерах пробанда, предполагается, что риск рецидива низок [1, 8].

Передача мутаций мтДНК по материнской линии хорошо описана и определена [5], хотя исход конкретных беременностей остается непредсказуемым, особенно для гетероплазменных расстройств. Bо многом это связано с генетической элиминацией, происходящей во время раннего развития [1, 3], что приводит к значительным изменениям в ДНК и мутантной нагрузки в потомстве [5]. Многие из клинических симптомов коррелируют с соотношением количества мутантной мтДНК и количества мтДНК дикого типа (или абсолютного количества ДНК дикого типа), соответственно исход для каждой беременности сложно предсказать [1, 4, 5, 9, 10].

В случае гомоплазменных расстройств мтДНК мутация передается всему потомству [1, 5]. Однако даже у таких пациентов развитие клинических признаков трудно предсказать, поскольку существует переменная пенетрантность, по-видимому, за счет сочетания действия факторов окружающей среды и генетического контроля ядра [5]. Таким образом, генетическое консультирование семей с митохондриальными заболеваниями остается сложной задачей [1, 9, 10].

Донорские яйцеклетки от неродственного человека являются вариантом профилактики передачи мутаций мтДНК потомству. Тем не менее, несмотря на то что оплодотворение производится с помощью спермы отца, ребенок будет иметь ядерный генотип донора и генетическое родство лишь с отцом [1]. Некоторые женщины, нуждающиеся в донорских яйцеклетках, высказывают беспокойство по этому поводу и испытывают тяжелый психологический дискомфорт, вплоть до симптомов депрессии [11]. Кроме того, во многих странах существуют различные сложности с получением донорских яйцеклеток и выбором донора ооцитов. Другое ограничение — на данную процедуру часто затрачивается больше времени, чем на стандартную программу ВРТ с собственными ооцитами, во многом из-за времени ожидания донора [1, 11].

Амниоцентез и биопсия ворсин хориона широко применяются для диагностики хромосомных аномалий и могут быть использованы для диагностики мутаций мтДНК. Когда эти методы были использованы для диагностики конкретных мутаций мтДНК (8993T>G, 8993T>C), результаты повлияли на тактику ведения беременности [1, 7]. В случае гетероплазменных расстройств мтДНК часто отмечаются тканево-специфические различия в уровне гетероплазмии, в результате чего сомнительно утверждать, что данный тест будет точно отражать исход для плода. Тем не менее существующие данные свидетельствуют о том, что в большинстве случаев это не является проблемой [1, 5]. Используя данный тест, возможно лишь предсказать исход для очень высокого либо очень низкого уровня гетероплазмии и лишь для некоторых мутаций. Прогноз затруднен для промежуточных значений [7, 12].

Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) позволяет анализировать мтДНК из полярных тел неоплодотворенных ооцитов, отдельных бластомеров 6—8 клеточных эмбрионов либо клеток трофэктодермы с последующим переносом в полость матки только здоровых эмбрионов. В настоящее время ПГД — метод выбора для пациентов с наследственными дефектами мтДНК [6, 13]. Показано, что каждая клетка имеет в среднем около 10 до 100 000 копий мтДНК [13]. Хотя число копий может различаться между клетками разных эмбрионов и разных стадий развития, высокое количество копий предполагает, что возможно провести программу ПГД для митохондриальных заболеваний. Существует опасение, что полярные тела или отдельные клетки не могут отражать реального количества ДНК от общего мутационного груза, хотя эксперименты на гетероплазмичных мышах и бластомерах человека показали однородное распространение в начале эмбриогенеза [1, 13].

Генетическое консультирование, ПГД и пренатальная диагностика могут быть полезны для некоторых пациентов с гетероплазменными мутациями мтДНК, но эти методы малоэффективны для терапии пациентов с гомоплазменными мутациями. Для этих семей важна разработка альтернативных методов, чтобы предотвратить передачу болезней мтДНК [1, 5, 13, 14].

В этой технике нормальные митохондрии цитопластов донора переносятся в ооцит реципиента и таким образом разбавляют эффекты любого дефекта мтДНК [15]. Перенос цитоплазмы между ооцитами человека был выполнен впервые, чтобы попытаться улучшить результаты ВРТ [12, 15]. Тем не менее некоторые из рожденных детей были гетероплазмичны с низким уровнем мтДНК от доноров ооцитов [1, 14]. Поэтому, вероятно, данный метод будет иметь небольшую ценность у пациентов с митохондриальной дисфункцией. Эксперименты на мышах показывают, что количество мтДНК донора при переносе цитоплазмы составляет меньше 1/3 общего количества мтДНК, таким образом, доля мтДНК дикого типа изменится мало. Кроме того, есть опасения, что перенос цитоплазмы может вызвать серьезные эпигенетические модификации [12], а также хромосомные аномалии [1, 14].

Альтернативная стратегия предполагает перенос ядерной ДНК от матери с болезнью мтДНК в энуклеированные ооциты или эмбрионы от здоровой женщины-донора ооцитов [12, 16, 17]. Существуют некоторые трудности, ассоциированные с данными процедурами. В стадии метафазы II ооцит не имеет ядерной мембраны, поэтому существует большой риск потери хромосом во время процедуры. Использование флуорофоров для визуализации хромосом в данном случае может повлиять на дальнейшее нормальное эмбриональное развитие. Если использовать ооциты в стадии зародышевого пузырька (GV), значительно снижается жизнеспособность полученных эмбрионов in vitro, что продемонстрировано на ооцитах человека и мыши [1, 8, 16, 17]. Тем не менее современные подходы к переносу ядерного генома в энуклеированные ооциты предполагают использование достаточно эффективных методов, протоколы процедур опубликованы и доступны [17—21]. Данная стратегия может быть реализована несколькими методами [17, 21], описанными ниже.

Стадия зиготы у млекопитающих характеризуется наличием двух пронуклеусов — мужского и женского, каждый отчетливо визуализируется и содержит гаплоидный набор хромосом ядерной (геномной) ДНК. Схематическое изображение переноса пронуклеусов зигот показано на рис. 1 [17, 21]. Перенос пронуклеусов между зиготами впервые был осуществлен в начале 1980 г. на мышах, демонстрируя, что манипуляции с зиготами мыши позволяют получить жизнеспособное потомство [22]. Сравнительно недавно перенос пронуклеусов между зиготами был использован для моделирования предотвращения передачи митохондриальных заболеваний [16]. Эффективность переноса пронуклеусов зигот на мышах характеризуется высоким митохондриальным переносом у потомства и остается низкой в 24% случаев [17, 23]. Это связано с неизбежным совместным переносом небольшого количества цитоплазмы, содержащей митохондрии и мутантную мтДНК (см. рис. 1). Таким образом, изоляция пронуклеусов, даже в небольших кариопластах, может привести к совместному переносу большого числа митохондрий [17]. Хотя большинство распространенных наследственных заболеваний мтДНК человека, как правило, связано с высоким уровнем мутантной мтДНК [5], эти результаты у мышей не предвещают широкого использования данного метода для терапии митохондриальных расстройств на человеческих зиготах [8, 17]. Тем не менее возможность переноса пронуклеусов между зиготами человека впервые продемонстрирована в 2010 г. [24]. L. Сraven и соавт. [17, 24] использовали для исследования аномальные зиготы, содержащие один или более двух пронуклеусов, которые обычно рутинно утилизируются в циклах ВРТ. Зиготы, содержащие два пронуклеуса, были реконструированы путем переноса одного пронуклеуса из полипронуклеарной зиготы в гаплоидные зиготы. Только половина реконструированных зигот содержала как мужской, так и женский пронуклеус в связи с трудностью дифференцировать их между собой в процессе процедуры. Реконструированные зиготы (n=36) культивировали до стадии бластоцисты. Три зиготы, или 8%, достигли стадии бластоцисты, анализ мтДНК показал низкий процент (менее 2%) митохондриального переноса. Несмотря на низкий процент полученных бластоцист, авторы [24] сделали заключение о перспективности переноса пронуклеусов зигот для терапии митохондриальных заболеваний у человека. Тем не менее в настоящее время невозможно оценить безопасность и эффективность переноса пронуклеусов зигот на нормальных человеческих эмбрионах. Основываясь на данном исследовании, дальнейшее изучение метода требуется для окончательного заключения об оправданности применения переноса пронуклеусов для терапии митохондриальных заболеваний у человека [3, 17, 21].

В 2009 г. был впервые выполнен перенос веретена деления на животной модели (макака-резус), демонстрируя, что высокая эффективность методики переноса ядерного генома может быть достигнута на стадии неоплодотворенных ооцитов [2]. В этих экспериментах продемонстрированы эффективность и безопасность переноса веретена деления: было получено жизнеспособное потомство, которое нормально развивалось (кривые роста не отличались от кривых роста контрольной группы), более того, уровень митохондриального переноса был низким (ниже 2%) [2, 17—21, 25]. Техническое описание протокола переноса веретена деления опубликовано [17—19] и показано на рис. 2. В отличие от зигот распределение митохондрий в ооцитах однородно, что позволяет осуществить перенос веретена деления без существенного митохондриального переноса мутантной мтДНК. Кариопласты объемом около 1,5% от объема донорского цитопласта содержали мейотическое веретено деления с небольшим объемом цитоплазмы. После реконструирования ооцитов производили оплодотворение методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ). Полученные эмбрионы культивировали до стадии бластоцисты. Качество и развитие бластоцист были сопоставимы с контрольной группой [2]. Пятнадцать бластоцист перенесли 9 суррогатным матерям, в результате чего получили три беременности и родились 4 живорожденных. Результаты были аналогичны результатам с нереконструированными эмбрионами [2, 17, 20].

Исследования на ооцитах человека от доноров с различными гаплотипами мтДНК были проведены в дальнейшем [25]. Из 106 яйцеклеток, пожертвованных для исследования, 65 были подвергнуты переносу веретена деления и 33 составили контрольную группу. Частота оплодотворения в экспериментальной группе составила 73% и была близка к контрольной (75%). Однако значительная часть (52%) зигот после переноса веретена деления продемонстрировала аномальное оплодотворение (чаще присутствие трех пронуклеусов) [17, 21, 25]. Уровень гетероплазмии в полученных эмбрионах был менее 1%. Результаты данного исследования согласуются с выводом, что перенос веретена деления может быть эффективным и безопасным методом терапии митохондриальных заболеваний с минимальным митохондриальным переносом [2, 3, 17].

Во время мейоза ооциты млекопитающих претерпевают два редуктивных деления с неравным цитоплазматическим разделением и образованием двух небольших тел, содержащих дополнительный набор хромосом. Первое полярное тело содержит диплоидный набор хромосом, а второе — гаплоидный набор. Завершение мейоза и выделение первого и второго полярных тел необходимо для правильного нормального эмбрионального развития [23, 26]. Перенос полярного тела в контексте терапии митохондриальных заболеваний был описан в литературе [21, 23] (рис. 3). В основе переноса полярных тел для терапии митохондриальных расстройств лежит то, что полярные тела содержат геномную ДНК и лишь несколько митохондрий. Помимо этого, полярные тела легко визуализируются и могут быть перенесены в донорские цитопласты [17]. Используя этот подход на мышиных ооцитах, одновременно переносили первое полярное тело и веретено деления (см. рис. 3), было получено 43 реконструированных ооцита. Рождаемость в экспериментальной группе была сопоставима с контрольной, и все живые щенки, полученные из реконструированных яйцеклеток, нормально развивались [17, 23, 26]. Однако перенос полярного тела не дал результатов в экспериментах на других млекопитающих, несмотря на значительные усилия [3, 12, 17]. У большинства видов после переноса полярного тела наблюдалась низкая жизнеспособность эмбрионов, фрагментация ДНК и дегенерация. В клинической практике полярные тела человека имеют большое значение для ПГД некоторых заболеваний, однако эффективность и безопасность переноса полярных тел для терапии митохондриальных расстройств еще предстоит определить. Следует отметить, что в связи с процессами рекомбинации в мейозе генетический состав полярных тел не идентичен генетическому составу ооцита или зиготы, вероятно поэтому перенос полярного тела малоэффективен [3, 17].

Генетическая консультация семей с митохондриальной дисфункцией имеет важное значение, так как риски передачи различаются для различных мутаций мтДНК. Врачи с опытом в этой области должны обеспечить правильное консультирование и поддержку семей с выявленным риском передачи заболевания потомству [1, 7].

В настоящее время ПГД является методом выбора для снижения риска передачи митохондриальных расстройств, особенно у женщин с низким уровнем гетероплазмии мтДНК [13]. Однако успешное использование ПГД зависит от количества эмбрионов высокого качества с низким уровнем мутантной нагрузки, что делает его непригодным для некоторых пациентов [1, 13].

Новые методы микроманипуляции с неоплодотворенными ооцитами и зиготами, которые являются альтернативой донорским яйцеклеткам представляют собой перспективное и многообещающее направление для профилактики заболеваний мтДНК [3, 12, 17]. Однако вопросы безопасности и эффективности этих методов должны быть тщательно изучены в дальнейшем. Ни одна из вышеописанных методик не гарантирует полной ликвидации мутантной мтДНК пациента. Поэтому необходимы дальнейшие исследования на животных моделях, доказывающие, что пенетрантность гетероплазмии мтДНК не повлияет на жизнеспособность потомства при всех методах микроманипуляции с ядерным геномом, до того, как данные методы войдут в клиническую практику [3, 8, 12]. Контроль безопасности не должен быть ограничен ранними стадиями развития, а должен быть продлен до наблюдения за взрослым потомством, предпочтительно в нескольких поколениях [3]. Имеющиеся данные, полученные на человеческих донорских ооцитах, относятся только к периоду раннего развития эмбрионов [25], этих данных явно недостаточно, чтобы считать данные методы безопасными. Исследования ранних событий методами наблюдения за морфокинетикой могут быть полезны [3]. Также немаловажно исследовать хромосомный статус полученных бластоцист, данные анализа транскриптома, протеома и эпигенома. Долгосрочный анализ последующих поколений на моделях животных требуется, чтобы обеспечить полное эмпирическое доказательство принципа отсутствия побочных эффектов после митохондриальной замены [3, 8, 12, 17, 21].

Несмотря на технические и этические проблемы этих подходов, митохондриальное донорство имеет большие перспективы, позволяющие женщинам, несущим мутации мтДНК, иметь генетически родственного ребенка без передачи мутантной мтДНК, тем самым предотвращая передачу митохондриальных расстройств [11, 12].

Законодательство, касающееся исследований с использованием половых клеток и эмбрионов, значительно варьирует в различных странах. В Соединенном Королевстве создан экспертный совет на базе HFEA (Human Fertilisation and Embryology Authority) для обзора методов по предотвращению митохондриальных заболеваний. С докладом по оценке безопасности и эффективности методов терапии митохондриальных заболеваний можно ознакомиться на сайте HFEA (www.hfea.gov.uk/6372.html). HFEA получило широкую общественную поддержку по вопросу митохондриального донорства в Великобритании [3]. Экспертный совет пришел к выводу, что методы переноса пронуклеусов зигот и веретена деления потенциально имеют большие приемущества для пациентов с серьезными наследственными заболеваниями мтДНК. Экспертный совет настоятельно рекомендует дальнейшие дополнительные исследования, чтобы обеспечить эффективность и безопасность этих методов до их клинического использования. Также рекомендовано долгосрочное наблюдение за детьми, рожденными в результате этих методик [3, 12, 21]. В июне 2013 г. Правительство Соединенного Королевства объявило о своем решении приступить к проекту правил, которые позволят использовать методы переноса ядерного генома и митохондриальной замены для лечения пациентов, а уже в 2015 г. эти методы были одобрены в терапевтических целях Палатой лордов Соединенного Королевства. Таким образом, Великобритания стала первой страной в мире, узаконившей технологии переноса ядерного генома для терапии митохондриальных расстройств, а первый ребенок может родиться уже в 2016 г.

Конфликт интересов отсутствует.

Информация об источнике финансирования:

Институт репродуктивной медицины, ТОО центр ЭКО