Преждевременная недостаточность яичников (ПНЯ), определяемая как гипогонадизм, в возрасте до 40 лет у женщин, ранее имевших нормальный менструальный цикл, может быть верифицирована путем получения минимум двух результатов повышенного уровня фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) (более 25 МЕ/л) с интервалом 4 недели [1]. Частота этой нозологии колеблется от 1 до 13% [2].
Принимая во внимание снижение овариального резерва у всех пациенток с различными формами ПНЯ, необходимо отметить значительную вариабельность клинико-лабораторных данных обследуемых женщин в рамках понятия «сниженный овариальный резерв», что означает необходимость детальной его верификации, прежде всего с целью оптимального выбора метода лечения бесплодия.
Возможности различных методов определения состояния овариального резерва сопоставляются в мировой литературе с конца 80-х годов XX века. В настоящее время актуальность изучения этого вопроса не ослабевает в связи с необходимостью реальной оценки функционального состояния яичников как определяющего фактора результативности методов лечения бесплодия. Влияние различных факторов на функциональное состояние яичников опосредует значительную вариативность биохимических и ультразвуковых характеристик, что нивелирует их диагностическую значимость в определении истинного овариального резерва.
Роль биопсии яичников в оценке состояния фолликулярного аппарата сегодня широко обсуждается. Биопсия яичников позволяет получить необходимые данные о состоянии преантральных и антральных фолликулов и может являться информативным методом изучения фолликулогенеза [3]. N. Massin и соавт. доказана более высокая диагностическая значимость биопсии яичника по сравнению с определением количества антральных фолликулов при помощи ультразвукового исследования [4]. Таким образом, несмотря на безусловное скрининговое значение определения ультразвуковых параметров и уровня антимюллерова гормона (АМГ) в сыворотке крови в оценке состояния овариального резерва, гистологическое исследование обладает большей информативностью в этом отношении прежде всего потому, что даже при малых размерах биоптата возможна детекция раннего фолликулярного роста (фолликулы до 2 мм в диаметре), что невозможно при ультразвуковом и гормональном исследовании в связи с отсутствием собственной стероидогенной активности фолликулов данного размера. Согласно данным литературы, биоптат яичника целесообразно получать у пациенток с бесплодием с предполагаемым сниженным овариальным резервом при лапароскопии по поводу трубно-перитонеального бесплодия с целью детальной оценки фолликулярного аппарата и определения дальнейшей тактики ведения в рамках лечения бесплодия [5].
Гистологическое исследование не только играет ключевую роль в диагностике большинства гинекологических заболеваний, являясь «золотым стандартом» их верификации, но и в ряде случаев может иметь проспективное значение в лечении бесплодия, в особенности у пациентов со сниженным овариальным резервом. Так, J. Zhai и соавт. используют гистологическое исследование как определяющий этап хирургического лечения, обосновывающий целесообразность выполнения реимплантации фрагментированной овариальной ткани [6]. В данном аспекте изучение гистологического строения ткани, которая подвергается механической активации, представляет интерес с фундаментальной точки зрения, так как вносит вклад в понимание гистологического строения ткани яичника у пациенток с ПНЯ, получающих заместительную гормональную терапию, а также позволяет выявить корреляцию между особенностями морфологических структур, представленных в объеме исследуемой ткани яичника, и репродуктивными исходами.
Цель исследования — изучить гистологическое строение ткани яичников женщин со сниженным овариальным резервом для выявления клинико-морфологических параллелей между результативностью лечения бесплодия и морфологической структурой фолликулярного аппарата.
Материал и методы
Проведен ретроспективный анализ результатов гистологического исследования 42 образцов ткани коркового слоя яичника, полученных в результате хирургического этапа в рамках комплексного лечения бесплодия 21 пациентки со сниженным овариальным резервом в ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.
Характеристика пациентов. Исследовано состояние овариального резерва у 21 пациентки репродуктивного возраста, страдающих бесплодием, резистентным к стандартным методам лечения, включая вспомогательные репродуктивные технологии. Пациентки не имели предшествующих операций на яичниках в анамнезе и получали заместительную гормональную терапию (Эстрадиола валерат 2 мг+Дидрогестерон 10 мг) в течение 2—3 менструальных циклов до операции с целью нормализации уровней гонадотропинов и эстрадиола и повышения эффективности комплексного лечения. Всем пациенткам по заключению репродуктолога рекомендована донация ооцитов как единственно возможный вариант достижения беременности.
На дооперационном этапе все пациентки проходили общеклиническое, эхографическое, клинико-лабораторное обследование. Всем обследованным после получения информированного добровольного согласия на участие в исследовании выполнено оперативное вмешательство в следующем объеме: лапароскопия, ревизия органов малого таза, биопсия коркового слоя обоих яичников с последующей его фрагментацией и одноэтапной реимплантацией в толщу яичника, гистероскопия, биопсия эндометрия, хромогидротубация.
После оперативного вмешательства всем пациенткам проведена стимуляция функции яичников при достижении оптимальных сывороточных уровней гонадотропинов и соответствующей ультразвуковой картины, свидетельствующей о наличии антральных фолликулов. Особенности ответа на овариальную стимуляцию сопоставлялись с данными гистологического исследования образцов ткани яичников, полученных в ходе операции.
Показания к операции: бесплодие, сниженный овариальный резерв, настойчивое желание реализовать репродуктивную функцию с использованием собственных ооцитов, а также отсутствие эффекта от проводимого ранее лечения, включая методы вспомогательных репродуктивных технологий.
Определение зоны биопсии ткани яичников. Во время лапароскопии после тщательной визуализации под оптическим увеличением с кратностью в 20 раз на основании данных, полученных при ультразвуковом исследовании, идентифицировали зону биопсии коркового слоя с учетом минимальной васкуляризации и достаточной толщины ткани яичников. Иссечение коркового слоя во всех случаях проводилось в области верхнелатерального полюса яичника острыми механическими ножницами по границе с мозговым слоем по всей площади биопсии размером 10×10 мм толщиной не более 1 мм.
Техника операции. Производится иссечение участка коркового слоя обоих яичников максимально вдоль поверхности органа. В условиях операционной в стерильном гаметном буфере специальным острым хирургическим инструментом выполняется микрохирургическая фрагментация иссеченного участка коркового слоя яичника до размеров 1×1 мм (около 100 фрагментов). В это же время осуществляется формирование пространства между остаточной корой и мозговым веществом ипсилатерального яичника и создание ниши в мозговом веществе, в область которой проводится одноэтапная реимплантация фрагментированной ткани. Далее производится ушивание ложа с использованием ареактивного шовного материала. Затягивание швов выполняется до сопоставления краев раны, что исключает перетягивание и ишемизацию ткани. При проведении описанного оперативного вмешательства не допускается использование каких-либо хирургических энергий. Для гистологической верификации состояния овариального резерва исследуется 10—20% объема каждого фрагмента биоптата яичников.
Макроскопическая картина ткани яичников. Яичники уменьшены в размерах, белесовато-желтого цвета, несколько уплощенной формы с крупнобугристой поверхностью, с утолщенной белочной оболочкой, глубокими бороздами и с некоторой анатомической асимметрией в пользу правого яичника, на разрезе — отсутствие признаков адекватной васкуляризации.
Гистологическая картина ткани яичников. Для детального морфометрического анализа состояния ткани яичников в каждом случае гистологическому исследованию подвергался участок 5×1 мм. В каждом случае оценивались от 1 до 11 фрагментов ткани яичников общими размерами от 2×4 до 15×15 мм.
Все образцы ткани подвергались обработке согласно стандартному гистологическому протоколу. Биоптаты объемом 3×3 мм фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 ч, после стандартного протокола гистологической проводки материал заливали в парафин. Далее серийные срезы (до 30) толщиной 4—5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование гистологических препаратов проводили на световом микроскопе при увеличении от ×50 до ×400. Гистологическое исследование биоптатов яичников выполняли в ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России, в патологоанатомическом отделении №1 (зав. отд. — д.м.н. А.В. Асатурова) с помощью микроскопа Axio Scope A1 (Karl Zeiss, Германия). Подсчет числа примордиальных и растущих полостных фолликулов, оценку состояния структур ооцитов проводили методом, разработанным для парафиновых срезов яичников при увеличении микроскопа ×100 и ×400 [6]. Подсчет числа растущих фолликулов производили согласно международной гистологической номенклатуре [7].
Результаты и обсуждение
Данное исследование направлено на детальное изучение гистологического строения ткани яичников при сниженном овариальном резерве, а также на выявление клинико-морфологических параллелей между результативностью лечения бесплодия и морфологической структурой фолликулярного аппарата.
В норме ткань яичника состоит из коркового и мозгового вещества, покрыта поверхностным эпителием яичника (ПЭЯ), который представляет собой разновидность мезотелия [8]. В корковом веществе яичника содержатся фолликулы разной степени зрелости (от примордиальных до третичных и преовуляторных) [9].
В ходе настоящего исследования установлено, что в 9 образцах овариальной ткани визуализировались первичные или примордиальные фолликулы. Их количество при оценке всего объема доступного для гистологического исследования материала было различным — от 1 до 10. С целью унификации их количество оценивалось в объеме ткани 1 мм3 и составило от 1 до 6 [10, 11]. В 6 образцах визуализировались кистозноатрезирующиеся фолликулы на разных стадиях развития, в 25 образцах — фиброзные тела. В отдельных случаях все эти гистологические признаки функциональной активности яичников обнаруживались одновременно, в ряде образцов (n=16) выявлялись только фиброзные тела (рис. 1—4). В настоящем исследовании только в 11 (26,2%) из 42 образцов не выявлено никаких признаков функциональной активности яичников, о чем свидетельствует отсутствие соответствующих стигм. В 21,42% определялись примордиальные/первичные фолликулы, в 15,28%— кистозноатрезирующиеся фолликулы на разной стадии развития и в 59,52% — фиброзные тела.
Рис. 1. Первичные и примордиальные фолликулы, окраска гематоксилином и эозином, ×100.
Рис. 2. Кистозноатрезирующийся фолликул, окраска гематоксилином и эозином, ×100.
Рис. 3. Фиброзное тело, окраска гематоксилином и эозином, ×100.
Рис. 4. Гиперклеточная строма без фолликулов, окраска гематоксилином и эозином, ×100.
При этом наряду с отсутствием стигм функциональной активности яичников корковый слой представлен гиперклеточной стромой, построенной из элонгированных веретеновидных клеток (рис. 5). Данные показатели морфологического исследования статистически значимо коррелировали с отсутствием эффекта от последующих стимуляций функции яичников (p<0,05). Из 8 пациенток, в образцах овариальной ткани которых отсутствовали какие-либо стигмы функциональной активности хотя бы в одном из яичников, у 6 из них не отмечен ответ на последующую стимуляцию функции яичников. У двух пациенток с наличием ответа на овариальную стимуляцию фолликулярный рост определялся в том яичнике, в образце которого при гистологическом исследовании выявлялись стигмы функциональной активности: в 1 случае — 1 примордиальный фолликул, еще в 1 случае — 2 фиброзных тела.
Рис. 5. Поверхностный эпителий яичника, окраска гематоксилином и эозином, ×200.
В 29 образцах отмечалось сохранение ПЭЯ, в 4 — в сочетании с развитием серозной поверхностной пролиферации (см. рис. 5, рис. 6). Площадь поверхности, покрытой поверхностным эпителием, варьировала от 1 до 30%. Обнаружена положительная корреляционная связь между сохранением ПЭЯ и длительностью течения заболевания и соответственно предшествующего лечения (p<0,05). У 13 (100%) пациенток с сохранением поверхностного эпителия на площади от 1 до 30% менструальный цикл был нарушен как минимум в течение 4 месяцев до оперативного лечения. У 6 (75%) из 8 пациенток с отсутствием ПЭЯ в гистологической структуре овариальной ткани не отмечено нарушений менструального цикла. В одном случае длительность аменореи составила 3 года, еще в одном — 9 месяцев.
Рис. 6. Серозная поверхностная пролиферация, окраска гематоксилином и эозином, ×100.
Следует отметить, что ПЭЯ является очень тонкой морфологической структурой, легко повреждающейся при малейшем артифициальном воздействии. Возможность визуализации этого эпителия в гистологических препаратах в 69,04% случаев может объясняться, с одной стороны, особой техникой оперативного вмешательства, с другой — особенностями структуры ПЭЯ и подлежащей стромы у этой группы пациенток.
Еще одной часто выявляемой гистологической структурой, косвенно свидетельствующей об овуляторной активности яичников, были инклюзионные кисты коркового слоя яичника. Они обнаружены в 9 образцах, при этом инклюзионные кисты, выстланные эпителием мезотелиального типа, выявлены в 3 образцах, выстланные высоким цилиндрическим эпителием типа слизистой оболочки маточной трубы — в 5 образцах, в 1 образце присутствовали инклюзионные кисты обоих типов (рис. 7—9). Инклюзионные кисты, как известно, образуются при инвагинации поверхностного эпителия яичника в корковый слой при заполнении участка овуляторного разрыва ПЭЯ или слущенным эпителием слизистой оболочки маточной трубы. В одном образце определено скопление текалютеиновых клеток.
Рис. 7. Инклюзионная киста, выстланная эпителием мезотелиального типа, окраска гематоксилином и эозином, ×100.
Рис. 8. Инклюзионная киста коркового вещества, выстланная эпителием типа слизистой оболочки маточной трубы, окраска гематоксилином и эозином, ×100.
Рис. 9. Фрагмент коркового слоя яичника с участком лютеинизации, окраска гематоксилином и эозином, ×100.
Произведена оценка сосудистого компонента стромы коркового вещества яичников, который представлен гиалинизированными микрососудами.
С целью унификации данных количество сосудов оценивалось в объеме 1 мм3. Число сосудов в данном объеме разнилось от 0 до 34. Установлено, что количество сосудов обратно коррелирует с наличием стигм функциональной активности и с результативностью последующих попыток стимуляции функции яичников (p<0,05). В образцах ткани яичников со стигмами функциональной активности (n=31) количество сосудов от 0 до 12 было со средним значением 7,56. Среди образцов без стигм функциональной активности (n=11) количество сосудов варьировало от 12 до 34 со средним значением 15,63 (p<0,05). Выявленные клинико-морфологические параллели могут свидетельствовать о включении компенсаторных механизмов трофики ткани яичника за счет выраженной васкуляризации.
Проведенное исследование морфофункциональной оценки ткани яичников у пациенток со сниженным овариальным резервом позволило выявить некоторые закономерности.
Имеются морфометрические особенности ткани яичников у пациенток с бесплодием, ассоциированным со сниженным овариальным резервом.
Определяются клинико-морфологические параллели между гистологической структурой ткани яичников и результативностью стимуляции функции яичников у пациенток со сниженным овариальным резервом.
Наличие фолликулярного аппарата и/или стигм функциональной активности при морфологическом исследовании статистически значимо коррелирует с результативностью стимуляции функции яичников.
При наличии ответа на овариальную стимуляцию фолликулярный рост определяется в том яичнике, в образце которого при гистологическом исследовании выявляют стигмы функциональной активности.
ПЭЯ является очень тонкой морфологической структурой, легко повреждающейся при малейшем воздействии. Возможность морфологической визуализации ПЭЯ является фактором, свидетельствующим о более глубоких изменениях в овариальной ткани. Сохранение ПЭЯ в гистологических образцах может быть следствием изменений самого ПЭЯ и подлежащей стромы коркового вещества яичника.
Наличие ПЭЯ на большей площади поверхности исследуемого образца ткани яичника свидетельствует о наиболее длительном течении заболевания и/или коррелирует с продолжительностью предшествующего лечения.
Сосудистый компонент стромы коркового вещества яичников у пациенток со сниженным овариальным резервом представлен гиалинизированными микрососудами. Выраженность сосудистого компонента коркового слоя овариальной ткани обратно коррелирует с ответом на стимуляцию функции яичников, что косвенно отражает компенсаторные механизмы восстановления трофики тканей за счет выраженной васкуляризации и свидетельствует о необходимости более раннего решения вопроса совместно с репродуктологами о возможности оперативного лечения.
Визуальная оценка ткани яичников во время лапароскопии (размеры, форма яичников, их поверхность, характеристика разреза) позволяет сформировать предположение относительно возможной ее функциональной активности, а гистологическая оценка ткани яичников косвенно определяет потенциал для хирургической активации.
Заключение
Для повышения результативности лечения женщин с бесплодием и сниженным овариальным резервом необходима комплексная оценка причин неэффективности предшествующей терапии. Полученные нами результаты морфофункциональной оценки состояния фолликулярного аппарата яичников у данного контингента больных свидетельствуют о глубоких изменениях в различных структурах яичников (в поверхностном эпителии, сосудистом компоненте, строме коркового слоя). Эти данные наряду с оценкой клинико-лабораторных показателей (уровней фолликулостимулирующего, лютеинизирующего, антимюллерова гормонов, эстрадиола и др.) и данных ультразвукового исследования (включая фолликулометрию) позволяют дать рекомендации о целесооб-разности своевременного (раннего) консультирования пациенток для решения вопроса о возможности проведения оперативного лечения: диагностической лапаро- и гистероскопии, установления иных причин бесплодия, возможного выполнения разработанного нами одноэтапного хирургического метода активации функции яичников. Такой подход позволит предотвратить развитие необратимых изменений в ткани яичников и повысить эффективность лечения [12]. Наш клинический опыт подтверждает эту рекомендацию.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.