Введение
Совершенствование и улучшение системы культивирования эмбрионов, внедрение продленного культивирования и криоконсервации методом витрификации позволили эффективно использовать эмбрионы на стадии бластоцисты и добиться высоких результатов. В ряде исследований показано, что эффективность переносов экспандированных бластоцист выше, чем при переносе дробящихся эмбрионов 3-х суток [1—5]. Одна из причин такой разницы в показателях — это остановка в развитии эмбрионов, не прошедших механизм активации. Именно на 3-и сутки начинается активация генома и эмбрионы останавливаются в развитии. Исходя из этого, сложно выбрать эмбрион, который достигнет стадии бластоцисты. Согласно данным K. Niakan и соавт., до стадии экспандированной бластоцисты доходят 50—60% эмбрионов, от всех дробившихся на 3-и сутки [6]. Продленное культивирование позволяет улучшить селекцию эмбрионов, повысить эффективность программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), уменьшить количество эмбрионов на перенос, а также проводить криоконсервацию оставшихся эмбрионов, развившихся в бластоцисты отличного и хорошего качества. Однако при одних и тех же условиях эмбрионы могут развиваться с разной скоростью и достигать стадии экспандированной бластоцисты на 6-й или даже на 7-й день развития. В ряде работ отмечено, что до 30% эмбрионов имеют замедленное развитие [7, 8].
Исследования показали, что при культивировании эмбрионов человека с последующим переносом на стадии бластоцисты не наблюдалось значительной разницы между эмбрионами 5-го или 6-го дня в качестве полученных бластоцист и ЧИ [9, 10]. Однако другие авторы обнаружили, что при переносе бластоцист 6-го дня наблюдается более низкая ЧИ по сравнению с переносом бластоцист на 5-е сутки [11, 12].
Наряду со стандартной методикой переноса 1—2 экспандированных бластоцист отличного/хорошего качества в клинической практике часто встречаются пациенты, у которых вся когорта эмбрионов развивается медленно и к 5-му дню развития эмбрионы достигают только стадии морулы/ранней бластоцисты. В случае, если программа проводится в сегментированном протоколе, то все эмбрионы, достигшие стадии экспандированной бластоцисты, криоконсервируют в зависимости от морфологической оценки качества на 5-й или 6-й день культивирования. Когда же перенос эмбрионов планируется в «свежем» протоколе, применяют другие подходы проведения заключительного этапа эмбриологического протокола: перенос морул/ранних бластоцист на 5-й день развития или перенос экспандированных бластоцист отличного/хорошего качества на 6-й день. Другой возможный вариант — продленное культивирование до 6-го дня с отменой переноса и витрификацией бластоцист лучшего качества (рис. 1).
Рис. 1. Варианты проведения заключительного этапа эмбриологического протокола в программах вспомогательных репродуктивных технологий (→ основные действия; ↔ варианты).
Цель исследования — определить оптимальную тактику переноса медленно развивающихся эмбрионов, сравнить эффективность переносов морул/ранних бластоцист на 5-й день развития в «свежих» протоколах и экспандированных бластоцист 6-го дня развития в программах переноса размороженных эмбрионов.
Материал и методы
Дизайн исследования
Одноцентровое ретроспективное рандомизированное контролируемое исследование. В соответствии с поставленной целью проанализированы данные пациентов, проходивших программу экстакорпорального оплодотворения/инъекции сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки (ЭКО/ИКСИ) с января 2013 по декабрь 2019 г., а также проходивших программу переноса размороженных эмбрионов (ПРЭ) с 2015 по 2019 г. в ТОО «ИРМ».
Анализ в группах
Для проведения данного анализа пациентки разделены на 3 группы: группа А (средний возраст пациенток 32,2 года, среднее количество эмбрионов на перенос 1,55) — 619 циклов с переносом морул/ранних бластоцист на 5-й день развития в «свежих» протоколах и группа Б (средний возраст пациенток 31,5 года, среднее количество эмбрионов на перенос 1,5) — 211 циклов с переносом экспандированных бластоцист 6-го дня в программах ПРЭ. В качестве контроля взята группа В (средний возраст пациенток 30,9 года, среднее количество эмбрионов на перенос 1,58) — 2 747 криоциклов с переносом бластоцист, витрифицированных на 5-й день развития.
Критерии соответствия
Критерии включения: пациентки с диагнозом бесплодие, связанное с трубно-перитонеальным фактором, мужским фактором, сочетанием перечисленных выше факторов, а также идиопатическое бесплодие, возраст до 40 лет на момент прохождения 1-й или 2-й программы ЭКО/ИКСИ с использованием собственных ооцитов.
Критерии исключения: использование донорских ооцитов и донорской спермы, циклы с суррогатным материнством, программы с переносом эмбрионов после преимплантационного генетического тестирования анеуплоидий (ПГТ-А), циклы, в которых переносили бластоцисты, замороженные на 5-й и 6-й день одновременно, а также программы, в которых переносили одновременно морулы или ранние бластоцисты вместе с экспандированными бластоцистами.
Оплодотворение и культивирование эмбрионов
Трансвагинальную пункцию фолликулов проводили спустя 36—38 ч после введения триггера — хорионического гонадотропина человека. В зависимости от истории болезни пациентов оплодотворение проводили методом ЭКО или ИКСИ спустя 3±1 ч после забора ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК). Через 16—18 ч после инсеминации/инъекции оценивали оплодотворение, зиготы, которые имели 2 пронуклеуса и 2 полярных тела, культивировали до 5—6-х суток в группах с использованием линейки сред «Origio» (Дания) в миниинкубаторах Planer («Planer plc», Великобритания) в газовой фазе 6,0% CO2, 5% O2 и 89% N2.
Оценка качества и перенос эмбрионов
На 5-й и 6-й день качество бластоцист (рис. 2—4) оценивали по классификации Gardner, в которой учтены степень экспансии, качество внутриклеточной массы и трофэктодермы [13]. В случае, если планировался перенос в «свежем» цикле, отбирали 1 или 2 экспандированные бластоцисты отличного (AA) или хорошего качества (AB, BA, BB) (см. рис. 2). В случае, если на 5-й день вся когорта эмбрионов отставала в развитии, на перенос отбирали морулы или ранние бластоцисты (степень экспансии 1) (см. рис. 3). Всем размороженным бластоцистам, а также «свежим» морулам/ранним бластоцистам выполняли вспомогательный хэтчинг, используя лазер Saturn 5 Active™ («Research Instruments Limited», Великобритания). Перенос размороженных и «свежих» эмбрионов в полость матки проводили в среде UTM™ («Origio», Дания) под ультразвуковым контролем.
Рис. 2. Экспандированные бластоцисты отличного и хорошего качества (а—в) (фотографии лаборатории ВРТ, ИРМ).
Рис. 3. Морула (а) и ранние бластоцисты (б, в) (фотографии лаборатории ВРТ, ИРМ).
Рис. 4. Бластоцисты низкого качества (а—в) (фотографии лаборатории ВРТ, ИРМ).
Витрификация и разморозка бластоцист
Экспандированные бластоцисты отличного и хорошего качества криоконсервировали на 5-е и/или 6-е сутки (см. рис. 2). Витрификацию бластоцист проводили, используя наборы Cryotop Vitrification Kit VT801 («Kitazato», Япония) и открытые носители типа Cryotop («Kitazato», Япония). На каждый носитель помещали одну или две бластоцисты. Оставшиеся морулы/ранние бластоцисты продолжали культивировать до 6-х суток. В случае, если они достигали стадии экспандированной бластоцисты отличного или хорошего качества, их также витрифицировали. Криоконсервацию бластоцист низкого качества (CC, CB, BC, CA, AC) не проводили, такие эмбрионы исключали из исследования (см. рис. 4). Разморозку бластоцист проводили утром в день переноса, используя среды Oocyte/Embryo Thawing Media VT602 («Kitazato», Япония). В течение 2 часов размороженные бластоцисты культивировали в миниинкубаторах («Planer plc», Великобритания) в газовой фазе 6,0% CO2, 5% O2 и 89% N2, в каплях одноступенчатой среды под минеральным маслом («Origio», Дания). Выживаемость и качество бластоцист после разморозки оценивали через 1—2 часа после полного реэкспандирования.
Статистический анализ
Статистическая обработка данных выполнена с использованием программы Statistica 10.0 для Windows. Для оценки статистически значимых различий между двумя выборочными распределениями (для выборок разного объема) использовали сравнение по методу χ2 Пирсона (критерий соответствия), анализируя различия между реально существующими частотами в группах с ожидаемыми «гипотетическими» частотами, соответствующих распределению χ2. Имеющиеся различия частот в сравниваемых совокупностях для анализируемого признака при парных сравнениях считали статистически значимыми при уровне значимости p<0,05 [14].
Принципы расчета размера выборки: размер выборки при проведении данного исследования предварительно не рассчитывали.
Результаты
Объекты (участники) исследования
Объектами данного ретроспективного исследования были медицинские карты пациентов, а также данные медицинской информационной системы.
Основные результаты исследования
Сравнение результатов эффективности переносов морул/ранних бластоцист на 5-й день в «свежих» протоколах и переносов размороженных бластоцист, экспандированных на 6-й день, представлены в табл. 1. Анализ результатов переносов морул/ранних бластоцист на 5-й день развития в «свежих» протоколах с эффективностью переносов экспандированных бластоцист 6-го дня в программах ПРЭ показал статистически значимое снижение в частоте наступления клинической беременности (ЧКБ) и частоте прогрессирующей беременности (ЧПБ) (17,7 по сравнению с 47,8% и 11,9 по сравнению с 37,4% соответственно). ЧИ была статистически значимо выше (p<0,001) при переносе размороженных бластоцист, экспандированных на 6-й день (35,7%), по сравнению с переносом в «свежих» протоколах морул/ранних бластоцист на 5-й день (12,6%). Наблюдалось статистически значимое увеличение ранних потерь беременности у женщин группы А по сравнению с пациентками группы Б 35,3 и 18,9% соответственно (p<0,01). Частота живорождения у женщин группы А была статистически значимо ниже, чем у пациенток группы Б и составила 10,5 и 35,5% соответственно (p<0,001).
Таблица 1. Эффективность переносов «свежих» морул/ранних бластоцист на 5-й день развития (группа А) по сравнению с переносом размороженных экспандированных бластоцист 6-го дня развития (группа Б)
| Параметры | Группа А | Группа Б | p (χ2 Пирсона) |
| ЧКБ, % | 17,7 (110/619) | 47,8 (101/211) | <0,001 |
| Частота имплантации, % | 12,6 (119/946) | 35,7 (111/311) | <0,001 |
| ЧПБ (скрининг, 12 недель), % | 11,9 (74/619 | 37,4 (79/211) | <0,001 |
| Ранняя потеря беременности (до 12 недель, %) | 35,3 (42/119) | 18,9 (21/111) | <0,01 |
| Частота живорождения, % | 10,5 (65/619) | 35,5 (75/211) | <0,001 |
Примечание. ЧКБ — частота наступления клинической беременности; ЧПБ — частота прогрессирующей беременности.
На следующем этапе исследования оценивали эффективность переносов эмбрионов с замедленным развитием, которые достигли стадии экспандированной бластоцисты на 6-й день, по сравнению с экспандированными бластоцистами 5-го дня в криоциклах (табл. 2).
Таблица 2. Показатели эффективности программ при переносе размороженных эмбрионов человека в зависимости от дня экспансии бластоцист
| Параметры | Группа Б | Группа В (контроль) | p (χ2 Пирсона) |
| ЧКБ, % | 47,8 (101/211) | 51,4 (1412/2747) | 0,322 |
| Частота имплантации, % | 35,7 (111/311) | 36,5 (1586/4345) | 0,774 |
| ЧПБ (скрининг, 12 недель), % | 37,4 (79/211) | 38,2 (1052/2747) | 0,805 |
| Ранняя потеря беременности (до 12 недель), % | 18,9 (21/111) | 22,5 (358/1586) | 0,593 |
| Частота живорождения, % | 35,5 (75/211) | 37,3 (1027/2747) | 0,371 |
Примечание. ЧКБ — частота наступления клинической беременности; ЧПБ — частота прогрессирующей беременности.
При сравнении эффективности программ переноса размороженных бластоцист, экспандированных на 6-е или 5-е сутки, не выявили статистически значимых различий (p>0,05) в ЧКБ (47,8 и 51,4%), ЧПБ (37,4 и 38,2%), а также в ЧИ (35,7 и 36,5%) соответственно. Данные исследования показали, что при статистическом анализе с применением критерия χ2 Пирсона не выявлены различия в частоте ранних потерь беременности (до 12 нед) у женщин групп Б и В (18,9% по сравнению с 22,5%) и в частоте живорождения при переносе размороженных бластоцист, витрифицированных на 6-й или 5-й день (35,5% по сравнению с 37,3% соответственно), p>0,05.
Обсуждение
Критически и психологически важным этапом программы ВРТ для пациентов с медленно растущими эмбрионами является правильный выбор тактики: перенос морул/ранних бластоцист на 5-й день развития в «свежем» цикле или перенос в криопротоколах размороженных бластоцист 6-го дня развития. От этого зависят такие важные показатели эффективности, как ЧКБ, ЧИ, ЧПБ, ранние потери беременности, живорождение и в целом исход программ. Одна из возможных причин снижения частоты наступления клинической и прогрессирующей беременности, ЧИ, а также частоты живорождения — это асинхронность стадии развития эмбриона и эндометрия. Вероятно, когда эмбрион, развившийся до морулы/ранней бластоцисты, достигнет стадии экспандированной бластоцисты, способной к имплантации, то «имплантационное окно» эндометрия будет закрыто [15—18].
Наряду с введением в практику продленного культивирования эмбрионов человека современные лаборатории ВРТ отдают предпочтение криоконсервации эмбрионов методом витрификации на стадии бластоцисты, что позволяет им:
— выбрать оптимальную тактику для оценки и выбора «лучшего» эмбриона на перенос, тем самым уменьшить количество переносимых эмбрионов и снизить вероятность наступления многоплодной беременности;
— максимально увеличить кумулятивную частоту наступления беременности на трансвагинальную пункцию фолликулов в программах ВРТ;
— увеличить ЧИ и переносить по одному размороженному эмбриону, тем самым улучшая результативность программ ПРЭ, так как криоконсервация на стадии бластоцисты позволяет более широко и эффективно использовать эмбрионы по сравнению с заморозкой эмбрионов более ранних стадий развития. Комплекс мер по усовершенствованию методов с целью улучшения показателей жизнеспособности криоконсервированных эмбрионов и оптимальный отбор экспандированных бластоцист для витрификации может стать приоритетным и эффективным вариантом лечения бесплодия [19—21].
Опубликованы противоречивые исследования об эффективности программ ВРТ, в которых отмечено, что уровень анеуплоидий влияет на скорость развития эмбрионов. По данным S. Tannus и соавт., низкая эффективность при переносе морул может объясняться тем фактом, что около 28% таких эмбрионов останавливаются в развитии и не начинают бластуляцию [22]. В своей работе L. Kroener и соавт. связали высокий уровень анеуплоидий с остановкой в развитии морул и отсутствием бластуляции. Показано, что уровень анеуплоидий у эмбрионов, которые находились на стадии морулы на 5-й день развития, но достигавшие стадии бластоцисты позже, был значительно ниже, чем у морул, которые остановились в развитии, а именно 79,8% по сравнению с 92,9%. Однако при сравнении непосредственно бластоцист, экспандированных на 5-й или 6-й день, различия в частоте анеуплоидий не обнаружены [23].
В исследовании A. Capalbo и соавт. не выявлена статистически значимая разница между частотой анеуплоидий и временем бластуляции. Так, у эмбрионов, достигших стадии экспандированной бластоцисты на 5-й, 6-й и даже 7-й день развития, не наблюдалось статистически значимых различий в частоте эуплоидности: 46,6, 39,8 и 43,5% соответственно [8].
Однако в альтернативном исследовании, выполненном S. Vaccari и соавт., показано, что в эмбрионах 6-го дня развития наблюдается более высокий уровень эуплоидности, чем у эмбрионов 5-го и 7-го дня [24]. Согласно данным исследования J. Nguyen и соавт., в эмбрионах, полученных от пациенток моложе 34 лет, более высокая частота эуплоидности наблюдается на 5-е сутки по сравнению с 6-ми или 7-ми, в то время как в группе пациентов в возрасте от 35 до 37 лет частота анеуплоидий наиболее высока у эмбрионов 7-х суток [25]. Частота возникновения анеуплоидий в эмбрионах человека увеличивается с возрастом женщины [26]. У женщин в возрасте от 38 до 47 лет до 61% всех эмбрионов могут быть анеуплоидными, при этом и у молодых женщин, до 35 лет, даже с хорошим прогнозом, может наблюдаться достаточно высокий уровень анеуплоидии [27, 28].
Морфологическая оценка эмбрионов, находящихся на стадии морулы, не дает достоверной информации о качестве будущей экспандированной бластоцисты. В исследовании J. Haas и соавт. выход бластоцист хорошего качества составил всего 17,7 и 35,9% из эмбрионов, находящихся на стадиях морулы и ранней бластоцисты на 5-й день развития [29]. Степень фрагментации морул коррелирует с выходом бластоцист хорошего качества. В исследовании M. Ivec и соавт. морулы классифицированы на 3 группы согласно степени фрагментации (<5%, 5—20% и >20%), выход бластоцист хорошего качества из эмбрионов на стадии морулы на 5-й день составил 43,3, 29,1 и 13,6% соответственно [30]. Однако эти результаты не дают полноценной картины о качестве бластоцисты, которая может развиться из морулы/ранней бластоцисты, выбранной на перенос. Хотя именно морфологическая оценка бластоцисты напрямую связана с уровнем анеуплоидии, как это продемонстрировано в работе A. Capalbo и соавт. Наблюдалась повышенная частота анеуплоидии у бластоцист с плохими морфологическими оценками и большая вероятность эуплоидии для эмбрионов с хорошими оценками. Экспандированные бластоцисты 5-го дня разделены на 4 группы согласно их морфологической оценке по системе Gardner: бластоцисты отличного (≥3AA); хорошего (3,4,5,6, AB и BA); удовлетворительного и плохого качества (3,4,5,6 BB, AC и CA). Степень эуплоидности данных эмбрионов была статистически значима и составила 56,4, 39,1, 42,8 и 25,5% соответственно [8].
Показано, что вероятность имплантации у эмбрионов, достигших стадии экспандированной бластоцисты на 6-й день, ниже, чем на 5-й при переносе в «свежем» протоколе вследствие снижения рецептивности эндометрия и закрытия «имплантационного окна», поэтому предпочтение отдается криоконсервации с последующим переносом размороженных эмбрионов [20]. Такой подход существенно увеличивает стоимость программы ВРТ, также появляется риск отсутствия бластоцист, пригодных для криоконсервации или дегенерации после разморозки. Подобного рода проблема может возникнуть при переносе ранних бластоцист и морул, существует риск закрытия «имплантационного окна» до того, как эмбрион начнет хэтчинг. Однако некоторые авторы полагают, что применение вспомогательного хэтчинга может ускорить процесс вылупления бластоцисты из зоны пеллюцида и увеличить ЧИ. Например, в исследовании L. Jelinkova и соавт. наблюдалось значительное увеличение ЧКБ и имплантации при переносе ранних бластоцист после полного удаления зоны пеллюцида по сравнению с контрольной группой, где зона пеллюцида оставалась интактной [31].
К вопросу об эффективности переноса размороженных бластоцист, экспандированных на 5-й или 6-й день, опубликовано множество противоречивых статей. В метаанализе, выполненном S. Sunkara и соавт., отмечено значительное повышение ЧКБ в программах ПРЭ при переносе бластоцист 5-го дня по сравнению с 6-м. Однако при сопоставлении эмбрионов по морфологическому признаку статистически значимых различий не было [32]. В исследовании L. Ferreux и соавт. частота живорождения оказалась выше при переносе бластоцист 5-го дня, чем 6-го, и составила 29,6 и 17% соответственно. Однако авторы отмечают, что выборка смещена в пользу бластоцист, экспандированных на 5-е сутки, доля бластоцист хорошего качества в группе переносов составила 82%, тогда как на 6-е сутки — 68% [33]. В другом исследовании эффективность криопереносов бластоцист 5-го дня была выше, однако в группе, где осуществляли перенос эмбрионов, витрифицированных на 6-е сутки, не исключены пациентки старшей возрастной группы, проходившие программу ВРТ с различной этиологией бесплодия [34].
Для выбора наиболее оптимальной и эффективной тактики следует учитывать скорость развития эмбрионов, время бластуляции и экспансии, а также качество бластоцист. В нашем исследовании мы проанализировали эффективность переноса морул/ранних бластоцист в «свежих» программах и сравнили с переносом бластоцист, экспандированных на 6-е сутки в сегментированном цикле. Для оценки эффективности последних выбрана контрольная группа с переносом замороженных бластоцист, экспандированных на 5-е сутки. Средний возраст пациенток сопоставим в каждой из групп. Анализ результатов показал статистически значимое снижение эффективности по ключевым показателям ЧКБ, ЧИ, ЧПБ и частоте живорождения, а также увеличение ранних потерь беременности у женщин группы «свежих» переносов морул/ранних бластоцист по сравнению с группой ПРЭ, экспандированных на 6-е сутки. Следует отметить, что статистически значимой разницы в эффективности криоциклов между бластоцистами, экспандированными на 5-й или 6-й день, не наблюдалось. Следовательно, день экспансии бластоцисты не влияет на ЧКБ, ЧИ, ЧПБ, частоту ранних потерь беременности и живорождение.
Выводы
При переносе эмбрионов в «свежих» протоколах следует отбирать экспандированные бластоцисты отличного/хорошего качества 5-х суток развития. В случае, если вся когорта эмбрионов имеет замедленное развитие, рекомендуется продолжить культивирование эмбрионов до 6-х суток с последующей криоконсервацией бластоцист отличного/хорошего качества и выполнить программы переноса размороженных эмбрионов уже в другом цикле. Продленное культивирование до 6-го дня развития позволяет увеличить количество доступных эмбрионов, а также улучшить селекцию, тем самым сократив количество эмбрионов на перенос.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Полумискова А.О., Джусубалиева Т.М.
Сбор и обработка материала — Полумискова А.О.
Статистический анализ данных — Полумискова А.О., Тевкин С.И.
Написание текста — Полумискова А.О., Тевкин С.И.
Редактирование — Тевкин С.И., Шишиморова М.С.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.