В мировой литературе сообщения о методах, определяющих состояние овариального резерва (ОР), стали появляться с конца 80-х годов XX века. В настоящее время интерес к изучению этого вопроса не ослабевает. Обсуждается роль новых факторов, возможно, способных наиболее точно отразить функциональное состояние яичников. Существуют следующие методы определения состояния овариального резерва:

— гормональные тесты: базальный уровень ФСГ, соотношение ФСГ/ЛГ, базальный уровень эстрадиола;

— ультразвуковой метод: измерение объема яичников, определение числа антральных фолликулов (ЧАФ), допплерометрическое исследование кровотока в яичниках;

— уровень антимюллерова гормона (АМГ);

— подсчет числа фолликулов в биоптатах яичников.

Влияние различных факторов на функциональное состояние яичников определяет значительную вариабельность биохимических и ультразвуковых характеристик, что нивелирует их диагностическую значимость в дефиниции ОР.

В настоящее время для оценки состояния ОР в практике используют уровень АМГ в сыворотке крови [1].

Впервые измерение АМГ как метод определения ОР был предложен D. Seifer и соавт. [2] в 2002 г. Они обнаружили, что у пациенток с числом полученных ооцитов 6 и менее (при использовании методов вспомогательных репродуктивных технологий) по сравнению с пациентками, у которых было получено 11 ооцитов и более, статистически различался уровень АМГ, измеренный перед началом гормональной стимуляции, — 1,0±0,4 и 2,5±0,3 нг/мл соответственно.

A. Hazout и соавт. [3] показали статистически значимое различие по уровню АМГ в группе пациенток, у которых наступила беременность после экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), и тех, у которых беременность не наступила. В группе женщин с наступившей беременностью уровень АМГ составил 2,4±0,9 нг/мл, в группе небеременных — 1,1±0,6 нг/мл (р<0,002). Возраст, базальный уровень ФСГ, ЛГ, ингибина В и эстрадиола в обеих группах пациенток не различались.

T. Ebner и соавт. [4] показали, что уровень АМГ может быть фактором, определяющим не только число ооцитов, полученных в программе ЭКО, но и их качество, т. е. отсутствие центральной темной грануляции и агрегации гладкого эндоплазматического ретикулума. Было показано, что пациентки с высоким уровнем АМГ имеют более высокую вероятность получения ооцитов хорошего качества, чем пациентки с низким уровнем этого гормона.

Роль биопсии яичников в оценке состояния резерва фолликулов в настоящее время широко обсуждают. Биопсия яичников позволяет получить необходимые данные о состоянии преантральных и антральных фолликулов и может являться информативным методом изучения фолликулогенеза. N. Massin и соавт. [5] на основании обследования 61 пациентки с крайне низким ОР доказана более высокая диагностическая значимость биопсии яичника по сравнению с определением ЧАФ при УЗИ органов малого таза, уровнем ФСГ, эстрадиола и ингибина В, особенно когда размер фолликулов менее 2 мм. Авторами проведено сравнение результатов гистологических и ультрасонографических исследований яичников женщин и показана надежность гистологических исследований биопсийного материала для оценки состава фолликулярного аппарата даже при малых размерах биоптата (5×2×2 мм), при которых можно обнаружить ранний фолликулярный рост, что невозможно сделать при ультрасонографическом исследовании (при котором определяются фолликулы диаметром только более 2 мм).

Цель работы — провести сравнительный анализ концентрации АМГ и гистологических параметров биоптата яичников в оценке состояния ОР у пациенток с бесплодием.

В соответствии с поставленной целью были обследованы 89 пациенток с предполагаемым сниженным ОР, которые готовились к плановой лапароскопии: 35 пациенток с доброкачественными образованиями одного или обоих яичников; 25 пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием; 25 пациенток, планирующих диагностическую лапароскопию по поводу бесплодия, и 4 пациентки с сочетанным фактором бесплодия. Возраст всех обследованных колебался от 18 до 43 лет, составив в среднем 31±6,25 года.

Кроме общеклинического и гинекологического обследования, нами были использованы следующие методы исследования: количественное определение концентрации АМГ в сыворотке крови до оперативного вмешательства и микроскопическое исследование гистологических срезов биоптатов яичников, полученных в ходе оперативного вмешательства. Все пациентки дали согласие на участие в исследовании. Протокол исследования одобрен этическим комитетом Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова.

Для оценки состояния ОР исследовали концентрацию АМГ в сыворотке крови до оперативного вмешательства (n=72).

Определение концентрации АМГ выполнено методом иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA) с помощью наборов реактивов. Нормальными значениями концентрации АМГ для женщин репродуктивного возраста принято считать колебания от 1,0 до 12,5 нг/мл [6—11].

Лапароскопию проводили в гинекологическом отделении ГБУЗ «Центр планирования семьи и репродукции». Операцию выполняли в первую фазу менструального цикла по общепринятому методу. При лапароскопии визуально оценивали внутренние половые органы, размеры яичников, выраженность сосудистого рисунка. Для гистологического исследования выполняли биопсию одного из яичников.

Нами проведена оценка состояния ооцит-фолликулярной системы яичников женщин (n=89). В качестве материала использовали биоптаты яичников объемом 0,5 см³, полученные в ходе оперативного вмешательства на органах малого таза по показаниям в соответствии с приказом Минздрава России № 572н от 01.11.12 «Приложение № 20». Для световой микроскопии 43 биоптата фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине и 46 биоптатов — в смеси Буэна, приготовленной ex tempore. После гистологической проводки в спиртах восходящих концентраций, ксилолах и заливки в парафин срезы толщиной 7—8 мкм, размещенные на предметные стекла, окрашивали гематоксилином Эрлиха с подкраской эозином, обезвоживали и заключали в канадский бальзам. Гистологическое исследование биоптатов яичников выполняли в ФГБНУ «Медико-генетический научный центр», в лаборатории генетики нарушений репродукции (д.б.н., проф. Л.Ф. Курило) с помощью микроскопа Биомед 4. Выполнена количественная и качественная оценка фолликулов разных стадий развития, определен их диаметр. Подсчет числа примордиальных и растущих фолликулов, оценку состояния структур ооцитов проводили по методу, разработанному для парафиновых срезов яичников [12]. Подсчитывали число растущих фолликулов согласно международной гистологической номенклатуре [13]. При изучении фолликулярного состава яичников в среднем на один биоптат размером 0,5 см³ приходилось 96±34 среза. Общее число проанализированных срезов у всех пациенток составило 8284. На срезах подсчитывали количество примордиальных (ПФ), первичных (ПвФ), двух—трехслойных (Дв.Ф., Тр. Ф), многослойных (Мн.Ф), малых антральных фолликулов (Ант.Ф), измеряли их диаметр.

В работе использованы стандартные методы статистической обработки с программным обеспечением для ПК: Microsoft Excel и Statistica 7.0. Количественные показатели представлены в виде среднего (M) и стандартного квадратического отклонения (M±SD), а также медианы (Me) и перцентилей (P) — Me (25-й P; 75-й P). Использованы методы описательной статистики. Критический уровень значимости для всех критериев и тестов принимали равным 5%, т. е. нулевую гипотезу отвергали при р<0,05. Применен общепринятый способ оценки клинической информативности прогностических тестов — ROC-анализ (Receiver Operating Characteristic analysis).

Среди обследованных 89 пациенток жалобы на бесплодие предъявили 64 (71,91%) (продолжительность бесплодия составила от 1 года до 15 лет). У 11 (17,19%) пациенток из 64 в анамнезе были одни роды, у 1 (1,56%) — двое родов, у 52 (81,25%) не была реализована репродуктивная функция.

У 7 (7,87%) пациенток из 89 в анамнезе имелась операция на яичниках по поводу доброкачественного образования, у 6 (6,74%) — тубэктомия (1 туботомия), у 25 (28,09%) — воспалительные заболевания органов малого таза, у 2 (2,25%) — лимфогранулематоз с последующей химиотерапией. 9 (14,1%) женщин были позднего репродуктивного возраста (старше 35 лет).

С учетом данных литературы о показателях нормального, сниженного и крайне низкого ОР [9—11], 72 пациентки были разделены на три группы по уровню АМГ: а) c нормальным ОР (n=65), б) cо сниженным ОР (n=4), в) с крайне низким ОР (n=3) (табл. 1).

Основную группу составили пациентки с нормальным ОР (90,3%), со сниженным и с крайне низким ОР — 5,6 и 4,2% соответственно.

При индивидуальном анализе концентрации АМГ в группе с нормальным ОР у большинства наблюдаемых уровень гормона колебался от 1,1 до 4,2 нг/мл.

Известно, что АМГ у женщин вырабатывается клетками гранулезы преантральных и малых антральных фолликулов, является ответственным за переход покоящихся примордиальных фолликулов в фазу активного роста, а также, возможно, за выбор на ранней антральной стадии чувствительных к ФСГ фолликулов [14, 15].

Учитывая эти данные, мы решили выявить корреляцию между уровнем АМГ и количеством растущих фолликулов, а также оценить значимость гистологического метода в диагностике состояния фолликулярного аппарата яичников у пациенток с бесплодием.

На проанализированных нами препаратах большинство фолликулов были примордиальными. Известно, что одним из основных показателей состояния овариального резерва является общее количество П.Ф. Предовуляторные фолликулы не были отмечены ни на одном из гистопрепаратов.

Для выявления связи между значениями АМГ и количеством фолликулов разных стадий развития в биоптатах яичников пациентки были разделены на 3 группы соответственно показателям АМГ (табл. 2).

При сравнении гистологических параметров ОР пациенток трех групп достоверных различий выявлено не было (р>0,05).

При сравнении уровня АМГ с количеством растущих фолликулов в биоптатах яичников корреляции также выявлено не было: с количеством первичных фолликулов (коэффициент корреляции Спирмена r_s=0,140 при уровне значимости α=0,189), двухслойных (r_s=0,147, α=0,167), трехслойных (r_s=0,055, α=0,604), многослойных (r_s=0,234, α=0,251), а также малых антральных (r_s=0,107, α=0,314).

В процессе работы нам удалось выяснить данные о наступлении беременности у 44 из 64 планирующих беременность (табл. 3).

Беременность наступила у 18 (40,9%) пациенток, из них самопроизвольная беременность — у 11: у 10 с нормальным ОР, у 1 со сниженным ОР. У 4 пациенток с нормальным ОР беременность наступила после ЭКО, у 3 — после контролируемой индукции овуляции. С крайне низким ОР беременность не наступила ни у кого. Частота наступления беременности у пациенток трех групп достоверно не различалась (р=0,756).

Для оценки прогноза наступления беременности по уровню АМГ был проведен ROC-анализ. Принципом ROC-анализа является сопоставление чувствительности и специфичности по уровню ложноположительных решений. В проведенном исследовании мы руководствовались тем, что чувствительность — это доля истинно положительных результатов среди пациенток с бесплодием, специфичность — доля истинно отрицательных результатов среди пациенток, не планирующих беременность. При анализе ROC-кривых придерживаются следующего принципа: чем ближе к левому верхнему углу координатной сетки расположена кривая (т.е. чем больше площадь под ROC-кривой), тем выше информативность исследуемого признака. Если кривая прилежит к диагонали (или совпадает), то информативность признака ничтожна (рис. 1).

Прогностическая значимость уровня АМГ по данным ROC-анализа оказалась крайне низкой (метод малочувствителен и малоспецифичен, площадь под кривой 0,5—0,6).

При морфологическом исследовании биоптатов яичников, по данным бинарной логистической регрессии, из всех анализируемых нами параметров только средний диаметр первичных фолликулов позволил значимо предполагать наступление беременности (р=0,018). Исходя из этого, мы разделили пациенток с морфологическим исследованием биоптатов на 2 группы: с нормальным ОР (диаметр первичных фолликулов менее 62 мкм) и со сниженным ОР (диаметр первичных фолликулов более 62 мкм).

В процессе работы нам удалось выяснить данные о наступлении беременности у 53 пациенток из 64 планирующих беременность (табл. 4).

Беременность наступила у 22 (41,5%) пациенток, из них самопроизвольная беременность — у 13 (59%): у 6 с нормальным ОР, у 7 со сниженным ОР. У 5 (9,4%) пациенток беременность наступила после ЭКО: у 3 с нормальным ОР, у 2 со сниженным ОР. У 4 — после контролируемой индукции овуляции (КИО): у 2 с нормальным ОР, у 2 со сниженным ОР.

У пациенток со сниженным ОР (диаметр первичных фолликулов более 62 мкм) достоверно реже наступала беременность (р=0,005). Мы провели ROC-анализ наступления беременности на основании диаметра первичных фолликулов (рис. 2).

По данным проведенного ROC-анализа область под кривой (AUC) составляет 0,783±0,089.

ROC-анализ позволил установить, что диаметр первичных фолликулов 62 мкм является оптимальным пороговым значением, при котором чувствительность прогнозирования наступления беременности составила 70%, специфичность 82%.

1. Из всех исследуемых параметров (концентрация АМГ в сыворотке крови, количество и диаметр фолликулов разных стадий развития в биоптатах яичников) значимым критерием оценки овариального резерва и соответственно прогностическим критерием наступления беременности является только диаметр первичных фолликулов (р=0,018).

2. Корреляции между уровнем АМГ в сыворотке крови и количеством растущих фолликулов не выявлено.

3. Полученные результаты подтвердили диагностическую и прогностическую значимость гистологического метода исследования в оценке состояния овариального резерва у пациенток с бесплодием.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.