В декабре 2019 г. в г. Ухане (Китай) была выявлена пневмония, связанная с тяжелым острым респираторным синдромом коронавируса 2 (SARS-CoV-2), названным Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) коронавирусом-2019 (COVID-19) [1—5]. Полость носа, носоглотка, ротоглотка и полость рта, слюнные железы были определены как потенциальные места репликации вируса SARS-CoV-2 [6, 7]. На фоне заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2, были описаны патологии со стороны слизистой оболочки рта и слюнных желез [8—10].
Протеомный анализ позволяет идентифицировать большое количество белков, сравнительный анализ которых у здоровых и больных людей позволяет выявить отличия, которые могут быть результатом изменений уровней циркулирующих белков, связанных с болезнью [11—13]. Более глубокие познания о потенциальных изменениях протеома слюны могут позволить идентифицировать новые диагностические биомаркеры или установить механизмы заболеваний полости рта, связанные с COVID-19 [14].
Цель исследования — провести протеомный анализ слюны для установления механизмов развития патологий в полости рта, вызываемых COVID-19.
Материал и методы
Пациенты с COVID-19, принимающие участие в исследовании, были госпитализированы в соответствии с диагнозом коронавирусная инфекция в инфекционное отделение Клинического Центра «COVID-19» в период январь—февраль 2021 г. Диагноз устанавливался на основании идентификации вируса ПЦР-анализом, компьютерной томографии легких с установлением картины течения полисегментарной вирусной пневмонии различной степени тяжести. Все пациенты получали противовирусную, провоспалительную, антиагрегационную и иммуномоделирующую терапию согласно протоколу лечения, утвержденном Минздравом РФ.
У пациентов осуществляли сбор смешанной слюны натощак, в утренние часы, без стимуляции путем сплевывания в пластиковые мерные пробирки. До начала исследования образцы замораживали при температуре –20 °C. Исследование слюны проводили на выборке из 10 образцов лиц, не болевших COVID-19, и 30 образцов пациентов, переболевших COVID-19. Все образцы слюны у пациентов с COVID-19 были собраны перед выпиской из стационара и отрицательного ПЦР-анализа на вирус. У участников исследования было получено информированное согласие. Наши исследования строго следовали стандартам, указанным в Хельсинской декларации.
Анализ образцов слюны проводили на квадрупольном времяпролетном масс-спектрометре Xevo G2-XS QToF (Waters, UK), сопряженном с системой хроматографии Acquity HPLC H Class Plus (Waters, UK). Регистрация ионов проводилась в гибридном информационно-независимом (DIA) режиме MSe-SONAR. Хроматографическое разделение проводили на колонке Acquity UPLC BEHC18. Расчетные величины содержания белка в пробе представлены в формате нг/мкг нагрузки на колонку. Анализ полученных данных проводили в программе PLGS (Protein Lynx Global Server, version 3.0.3, Waters, UK) с использование базы данных Uniprot KB (release March, 2021). Анализ значимости отличий между образцами слюны пациентов проводили с использованием статистического теста ANOVA при уровне значимости p<0,01. Для сравнения всех образцов слюны пациентов как независимых выборок данных применялся критерий Фишера.
Результаты и обсуждение
По результатам масс-спектрометрического анализа разброс размера протеомов составил от 107 до 201 белков в зависимости от образца. Анализ принципиальных компонент (РСА-анализ) показал расхождение группы контроля от группы пациентов с COVID-19 с вкладом компоненты РС1 50,4% и компоненты РС2 12,6%, что свидетельствует о различии между ними на протеомном уровне.
Анализ белков в базе GO аннотаций (p<0,01 и FDR <1%, коррекция Бонферрони при множественных тестах) показал, что подавляющее число значимо отличающихся белков в пробах слюны пациентов с COVID-19 принадлежит таким биологическим процессам, как иммунная реакция слизистых оболочек, процессы реорганизации хроматина и сборки нуклеосом, формирование ДНК-белковых комплексов, Ig-опосредованный иммунный ответ, нитрозилирование белков, активация В-клеток, адаптивный иммунный стрессовый ответ. Подобная картина свидетельствует о повреждении клеток тканей ротовой полости, активации клеток неспецифического иммунитета в ответ на контаминацию вирусных частиц.
Анализ сетевых белковых взаимодействий показал, что представленные белки обобщенного протеома когерентно принимают участие в формирование трех функциональных ансамблей (рис. 1). В иерархию молекулярных событий были отобраны лишь те процессы и белки, для которых p<0,001.
Рис. 1. Анализ сетевого взаимодействия между выявленными белками слюны у пациентов с COVID-19 общей части протеома.
Наиболее выраженный ансамбль формируется белками кератинами — KRT81, KRT83, KRT86, KRT34, KRT85, а также примыкающими белками второго уровня взаимодействий — AZGP1 (Zinc-alpha-2-glycoprotein/цинк-альфа-2-гликопротеин) и LCN1 (Lipocalin-1/липокалин-1). Все эти белки образуют последовательное и тесное сетевое взаимодействие, отражая активный процесс корнификации (гиперкератоза) (рис. 2) и образования корнеоцитов, являясь частью глобального биологического процесса развития (GO:0008544).
Рис. 2. Очаги корнификации эпителия слизистой оболочки щеки (а), языка (б), нижней и верхней губы (в, г) и у пациентов с COVID-19.
Второй ансамбль белков образован белками FABP5 (Fatty acid-binding protein-5/белок, связывающий жирные кислоты-5), ANXA2 (Annexin A2/аннексин А2), HSPB1 (heat shock protein family B (small) member 1/член 1 семейства белков теплового шока B (малый)), GFAP (Glial fibrillary acidic protein/глиальный фибриллярный кислый белок), POTEF (POTE Ankyrin Domain Family Member F/член F семейства анкириновых доменов POTE), которые вместе формируют единую линейную цепь участников процесса обновления клеток, утилизации белков и метаболизма жирных кислот.
Третья, последняя группа образована двумя белками H2BFS (Histone H2B type F-S/Гистон H2B типа FS) и HIST1H4F (Histone H4, which encoded by the HIST1H4F gene/Гистон H4, который кодируется геном HIST1H4F), которые являются прямыми участниками процессов ремоделлинга хроматина, клеточного цикла, образования нуклеосом и ДНК-белковых комплексов.
Сравнение всех образцов слюны пациентов с COVID-19 как независимых выборок данных показало, что критерий Фишера составил F=4,67765, а расчетный уровень значимости составил p=0,00167, что строго свидетельствует о имеющихся отличиях в течение и механизме патогенеза заболевания между пациентами различных кластерных групп. Из представленных нами данных показано, что конечным этапом развития биологических процессов с участием белков обобщенного протеома являются процесс корнификации (GO:0070268; p=4,56e-4, q=6,11e-1) и сопутствующий процесс регуляции воспаления (GO:0050727; p=6,43e-4, q=4,31e-1). При этом из представленных белков 33 имеют пересечение с GO-аннотированными белками воспаления и корнификации. Из их числа для 13 белков структурная функция является первичной (GO:0005198; p=2,45e-5, q=5,67e-3).
Заключение
Мы получили убедительные доказательства, что воздействие вируса опосредует разрушение клеток, о чем свидетельствует наличие в пробах слюны большое количество белков, ответственных за ядерный синтез, клеточный цитоскелет и содержимое цитозоля клеток. В ответ на действие вируса развивается воспалительная реакция, сопровождающаяся активацией клеток неспецифического иммунитета. В связи с этим, в период госпитализации и постковидной реабилитации пациентов с COVID-19 необходима разработка мер паллиативной помощи для профилактики и лечения деструктивно-воспалительных поражений тканей полости рта.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.