В последние годы с развитием экспериментальных методов повысился интерес к изучению физиологических жидкостей, содержащих биомаркеры, позволяющих проводить диагностирование и мониторинг развития болезней. Слезная жидкость (СЖ) - сложная биологическая среда, содержащая электролиты, белки, липиды, муцины, некоторые низшие органические кислоты и продукты метаболизма. Слезная пленка состоит из трех слоев: внутреннего - муцинового, среднего - водного, который содержит электролиты, белки и различные метаболиты, и внешнего - липидного. Как отмечено в ряде работ, капли СЖ могут содержать вещества, характеризующие определенные глазные болезни и даже системные заболевания [13]. В СЖ выделено до 60 фракций белков [1, 3]. Развитие современных методов анализа позволило расширить это число более чем до 100 и, очевидно, имеется еще больше [13]. При бактериальном конъюнктивите, после экстракции катаракты, при ношении контактных линз содержание общего белка умеренно повышается [7, 9]. В СЖ находятся факторы неспецифической защиты - лактоферрин, церулоплазмин, лизоцим (20-29% белка слезы обладает выраженным бактерицидным свойством на грамположительную флору), комплемент, β-лизин, пропердин [9, 12], иммуноглобулин, серум альбумин, липокалин, липофилин [13]. Большинство современных физико-химических методов анализа предполагает проведение хроматографических и масс-спектрометрических исследований, которые позволяют получить наиболее полную и достоверную информацию. Зачастую данные исследования весьма длительны и требуют наличия дорогостоящего оборудования и высококвалифицированных аналитиков. Это делает указанные способы исследования практически неприменимыми в медицине.

Механическая травма органа зрения является одной из основных причин утраты зрения и глаза как органа. Течение посттравматического процесса в 14-28% случаев осложняется хроническим воспалительным процессом, а в 7-25% - развитием внутриглазной инфекции, что в некоторых случаях (до 50%) приводит к резкому снижению зрения и трудоспособности лиц, получивших травму [2]. Ранняя диагностика и возможность прогнозирования характера течения и исходов травм глаза является актуальным направлением научных исследований в офтальмотравматологии. В последние годы возросло число публикаций, посвященных различным методам исследования СЖ.

В практической медицине возникла необходимость разработки простых исследований наряду со сложными высокоточными методами химического анализа СЖ. Достаточно широкое применение при различной глазной патологии нашло кристаллографическое исследование СЖ [6, 10,]. Инфракрасная (ИК) спектрометрия используется для диагностики сосудистых заболеваний органа зрения [4] и воспалительных процессов, протекающих в роговице, оценки эффективности проводимого лечения проникающих ранений [5]. К технически более простым и достаточно объективным, информативным методам относится ИК-спектроскопия [8], которая основана на изучении качественного состава и полуколичественном (относительная погрешность определения может составлять 10%, что значительно меньше количественного) анализе СЖ по спектрам поглощения кристаллических структур, образующихся при ее выпаривании. Как уже отмечено ранее, при нарушении обмена веществ в организме, повреждениях и заболеваниях органов зрения происходит изменение секреции белка в СЖ, направленные на восстановление возникшего дисбаланса. Метод спектрометрии часто используется в клинической практике, однако в случае травм роговицы наряду с изменением белкового состава возможно попадание липидов в СЖ [11], что необходимо учитывать при диагностике непроникающих (НРГ) и особенно проникающих (ПРГ) ранений глаза, при которых очевидно нарушение целостности слоев слезной пленки.

Целью настоящей работы являлась разработка способа экспресс-диагностики механической травмы роговицы с использованием ИК-спектроскопического анализа СЖ.

В рамках реализации указанной цели возможно решение следующих задач:

- дифференциальная диагностика характера ранений роговицы (проникающих, непроникающих);

- определение тактики, объема хирургического вмешательства при травмах роговицы, прогнозирование течения посттравматического процесса и своевременная профилактика осложнений.

Проводился анализ СЖ до и после лечения у пациентов с НРГ - 1-я группа, 25 человек (25 глаз) и ПРГ - 2-я группа, 25 человек (25 глаз). Контрольную группу составили 20 человек (40 глаз). Клинически у больных с травмой роговицы наблюдались: слезотечение, светобоязнь, повреждения в различных зонах роговицы в виде точечных, линейных, зигзагообразных ран с адаптированными краями, передняя камера была от 2,5 до 3 мм, зрачок 3 мм, реакция на свет живая, хрусталик и подлежащие отделы без патологии. Острота зрения от 0,08 до 0,5 н/к в зависимости от локализации раны. Всем больным проводились офтальмо-, эхо-, диафано- и биомикроскопия, обзорная рентгенография орбит. Результаты флюоресцеиновой пробы не у всех пациентов были четкими.

Для получения ИК-спектров образцов СЖ применяли специально разработанную методику (оформлена заявка на изобретение). Для регистрации ИК-спектров использовали в качестве оптически прозрачной подложки пластины монокристаллического кремния. Микрошприцем наносили 20 мкл СЖ на пластины кремния. После испарения при комнатной температуре жидкой фазы и кристаллизации компонентов СЖ на поверхности кремния регистрировали ИК-спектры образцов на ИК-спектрометре Bruker Vertex-70 с преобразованием Фурье. Полученные ИК-спектры количественно обрабатывали методом базисной линии с помощью программы OPUS. Сопоставление интенсивности полос поглощения, а также статистическую обработку данных проводили в оболочке табличного процессора Microsoft Excel. В качестве аналитического сигнала использовали величины относительных оптических плотностей (S_i/S₃), взяв площадь одной из полос в качестве полосы сравнения (S₃). В этом качестве выбрали полосу со средней интенсивностью при 1446-1452 см^-1. Ее интенсивность и сдвиг по шкале волновых чисел сравнительно слабо зависит от состояния СЖ.

Ранее в работе Н.К. Полянской [8] демонстрировалась возможность диагностики заболеваний роговицы и контроля над процессом лечения с применением типового ИК-спектрометра и общедоступного программного обеспечения. Методология исследования заключалась в проведении анализа ИК-спектров СЖ до, в процессе и после лечения пациентов с различной патологией заболевания роговицы, количественном определении содержания общего белка и сопоставлении полученных данных с результатами анализа в контрольной группе здоровых лиц. Эти исследования проводились при тяжелых деструктивных заболеваниях роговицы. Представленный подход может быть реализован и при диагностике глазного травматизма для дифференциальной диагностики проникающих, непроникающих ранений роговицы при отсутствии клинических данных. Данная методика позволяет определить тактику, объем хирургических вмешательств при механических травмах роговицы. На рис. 1

Анализ ИК-спектров СЖ показал, что для полученных образцов в контрольной группе присутствуют аналогичные полосы, при 1652 см^-1, 1403 см^-1, соответствующие деформационным колебаниям - NH-группы первичных амидов белка, и 1548 см^-1, 1260 см^-1, соответствующие деформационным колебаниям - NH-группы во вторичных амидах [3]. Различия проявились в общей и относительной интенсивности соответствующих полос. Чем больше интенсивность полосы около 1650 см^-1, тем выше содержание белковых веществ в СЖ. Интенсивность характеристичной полосы (обусловливает наличие веществ в ИК-спектре) наиболее адекватно соотносится с площадью пика (S) в ИК-спектре. При изменении структуры и соотношения количеств различных белковых веществ, обусловленных динамикой биохимических процессов, сопровождающих разные стадии заболевания, посттравматические изменения, интенсивность поглощения характеристичных полос, а значит, и соотношение площадей характеристичных пиков изменяются в различной степени.

Нами выявлены особенности ИК-спектров СЖ при травмах различного характера и установлена корреляция между тяжестью ранения и характером ИК-спектров СЖ. Так, при НРГ и ПРГ может значительно меняться состав СЖ, поскольку кроме белков в нее могут попадать липиды (слезные липиды, липиды на предшествующей поверхности роговичного эпителия и др.) [11]. Таким образом, состав слезы может меняться в широких пределах.

На рис. 2

Клинический пример 1. Пациент С., 35 лет, госпитализирован с диагнозом: правый глаз - глубокая непроникающая рана роговицы, инородное тело роговицы. Достоверных данных о характере повреждения роговицы (проникающее или непроникающее) клинически получить не удалось. У больного наблюдались: умеренное слезотечение, светобоязнь, в параоптической зоне роговицы зигзагообразная рана с адаптированными краями, передняя камера 3 мм, зрачок 3 мм, реагировал на свет живо, хрусталик и подлежащие отделы без патологии. Острота зрения была 0,2 н/к. Флюоресцеиновая проба нечеткая. При госпитализации проведен экспресс-анализ СЖ (рис. 3, табл. 3).

При проникающих ранениях возможно попадание в СЖ кроме белковых молекул и других компонентов.

В этих случаях возможно изменение относительных интенсивностей полос 1652, 1548, 1403, 1260 см^-1. В данных условиях можно наблюдать увеличение содержания белков в СЖ по сравнению с таковым в контрольной группе (табл. 4).

Клинический пример 2. Пациент М., 62 года, поступил в стационар с диагнозом: левый глаз - проникающая рана роговицы с контузионным компонентом. При поступлении клинически достоверно глубину повреждения роговицы определить не удалось. У больного наблюдались: умеренное слезотечение, светобоязнь, в параоптической зоне роговицы линейная рана с адаптированными краями, передняя камера была 2,5 мм, зрачок 3 мм, реагировал на свет живо, хрусталик и подлежащие отделы без патологии. Острота зрения была 0,3 н/к. Флюоресцеиновая проба нечеткая. Проведен экспресс анализ СЖ (см. табл. 4). Отношения S_i/S₃ для характеристичной полосы 1548 см^-1 S₄/S₃=2,46, для 1649 см^-1 S₅/S₃=4,81, что указывает на высокое содержание белков в СЖ по сравнению с таковым в контрольной группе. Относительное содержание белков при проникающем ранении ниже, чем при непроникающем, и обусловлено разбавлением СЖ внутриглазной жидкостью (влагой передней камеры). Анализ СЖ позволил диагностировать наличие проникающего ранения роговицы. Проведена первичная хирургическая обработка с последующей интенсивной противовоспалительной терапией, в том числе с применением антибактериальных препаратов широкого спектра действия в 1-е сутки после травмы. Это привело к выздоровлению и сокращению сроков стационарного лечения. Острота зрения при выписке составила 0,9-1,0.

1. Разработан метод экспресс-диагностики механической травмы роговицы на основе ИК-спектроскопии СЖ.

2. Дифференциальная диагностика в зависимости от характера ранения позволяет определить тактику консервативного или хирургического лечения.

3. Выбор адекватного метода лечения и объем позволяют снизить риск развития осложнений в посттравматическом периоде и ускорить сроки реабилитации пациентов.