1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

1. Особенности вариантов нуклеотидной последовательности гена ABCA4

1.1. Большое количество уникальных вариантов нуклеотидной последовательности

Гены человека содержат в среднем 9 экзонов [1]. ABCA4 содержит 50 экзонов, что позволяет отнести его к наиболее протяженным генам человека. Значительная длина гена — одна из причин большого количества генетических вариантов, выявленных в ABCA4. К настоящему времени описано уже 2194 варианта его последовательности (www.lovd.nl/ABCA4; дата обращения: 04.05.21). Варианты рассеяны на протяжении гена довольно равномерно и встречаются в каждом из 50 экзонов, поэтому оптимальный метод диагностики мутаций ABCA4 — это определение нуклеотидной последовательности всех экзонов гена и всех интрон-экзонных границ высокопроизводительным параллельным секвенированием (секвенированием нового поколения, NGS).

Исходя из того, что в гене ABCA4 уже описано 2194 варианта последовательности, и принимая во внимание рецессивную природу АВСА4-ассоциированных заболеваний, т.е. наличие у каждого пациента не менее двух мутаций, математически можно ожидать почти 5 млн уникальных генотипов (сочетаний мутаций). Если бы такое разнообразие генотипов наблюдалось на самом деле, работы по определению гено-фенотипических корреляций были бы невозможны: каждый пациент был бы уникален!

Однако в настоящее время не существует такого количества генетически обследованных пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями. Фактически 2194 генетических варианта, депонированных в базе данных LOVD (www.lovd.nl/ABCA4), отмечены у 16 186 обследованных индивидов. Такое несоответствие простой вероятностной оценки с реальным ограниченным разнообразием наблюдаемых генотипов объясняется влиянием характерного для многих рецессивных болезней эффекта основателя, в результате которого в популяциях накапливается небольшое количество распространенных (частых) мутаций. Среди российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ), так же как и в популяциях из других стран, выявлено несколько частых мутаций в гене АВСА4. Проведенные нами исследования [2] показали, что наиболее частыми у российских пациентов с БШ являются миссенс-мутации, приводящие к заменам аминокислот p.L541P, р.A1038V и p.G1961E (рис. 1). Мутации p.L541P и р.A1038V среди обследованных пациентов встречались в основном в составе гаплотипа, т.е. располагались на одной хромосоме, и должны анализироваться в связи с этим как единая комплексная мутация (понятие гаплотипов и их значимость в интерпретации результатов молекулярно-генетического анализа при АВСА4-ассоциированных заболеваниях будут рассмотрены ниже). В России p.G1961E отмечается у 37% пациентов, у которых выявлена по крайней мере одна мутация в гене АВСА4. Такая же высокая частота характерна для мутации p.[L541P;A1038V], а у 10% пациентов с БШ наблюдается генотип p.G1961E/p.[L541P;A1038V]. Таким образом, в реальности разнообразие генотипов по гену АВСА4 не столь велико, и этот факт позволяет проводить клинико-генетические корреляции и предполагать для каждого генетического варианта степень его патогенности.

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций гена ABCA4 у российских пациентов с болезнью Штаргардта (БШ).

1.2. Патогенные гаплотипы (комплексные мутации)

У пациентов с АВСА4-ассоциированными заболеваниями нередко обнаруживаются патогенные гаплотипы (комплексные мутации), когда две патогенные мутации локализуются на одной хромосоме (одном аллеле гена). Наиболее изучен гаплотип p.[L541P;A1038V], распространенный в России и в Центральной Европе, однако известно и множество других, в большей или меньшей степени представленных в различных популяциях. Например, в Центральной Европе второй по частоте патогенный гаплотип — p.[R152*;V2050L]; его частота среди польских пациентов превышает 4% [3], а в Бразилии [4] частыми считаются гаплотипы p.[L541P;R1443H] и p.[S1642R;V1682_V1686del].

Возможность обнаружения двух патогенных мутаций на одной хромосоме необходимо учитывать в исследовательской и медицинской практике во избежание неполного генотипирования пациентов. Выявление двух патогенных мутаций по результатам секвенирования ДНК пациента не может автоматически свидетельствовать об успешном завершении генотипирования и о полностью установленном молекулярно-генетическом диагнозе. В случае, когда две выявленные патогенные мутации расположены на одной хромосоме, необходимо продолжать поиск молекулярного повреждения второго аллеля гена, расположенного на другой хромосоме.

В большинстве случаев современные методы секвенирования образца ДНК пациента не позволяют различать ситуации, когда две мутации находятся на одной хромосоме (гаплотип) или на разных хромосомах (компаунд-гетерозиготное состояние). Уточнение расположения мутаций возможно по результатам анализа ДНК родителей пробанда. В молекулярно-генетической диагностике АВСА4-ассоциированных заболеваний сетчатки проведение анализа наследования мутаций абсолютно необходимо для точной постановки молекулярно-генетического диагноза.

Пример важности учета возможности расположения мутаций гена АВСА4 в составе гаплотипа демонстрирует рис. 2. В данной семье пробанд II-1 имеет клинический диагноз БШ. Предположим, что родители обратились за консультацией относительно прогноза манифестации БШ у младшего брата II-2 в возрасте 1,5 года. Результат генотипирования АВСА4 у II-2 показал наличие двух патогенных мутаций — p.L541P и р.A1038V. Исходя из рецессивной природы БШ, можно было бы предполагать, что выявления двух патогенных мутаций достаточно для молекулярно-генетического подтверждения БШ и вывода о неизбежной манифестации у него заболевания по достижении определенного возраста. Однако полное генотипирование всех членов семьи, представленное на рисунке, показывает, что такой вывод ошибочен, поскольку II-2 унаследовал мутации p.L541P и р.A1038V в виде гаплотипа и у него поврежден только один аллель гена АВСА4. Что касается пробанда II-1, то он унаследовал мутации p.[L541P;A1038V] от отца и р.R1443H от матери. Таким образом, у II-1 повреждены оба аллеля АВСА4, что и явилось причиной БШ. Результаты генотипирования его младшего брата, напротив, говорят об отсутствии у него предпосылок к развитию БШ с возрастом.

Рис. 2. Пример родословной семьи с БШ, с сегрегацией миссенс-мутации АВСА4 р.R1443H и гаплотипа p.[L541P;A1038V].

В России более чем у трети всех пациентов с БШ выявляют гаплотип АВСА4 p.[L541P;A1038V]. Это означает, что их генотип включает в себя патогенные мутации L541P и A1038V, составляющие комплексный аллель, и еще одну патогенную мутацию, расположенную на втором аллеле гена АВСА4. Обнаружение у пациента с БШ сразу трех мутаций в АВСА4 не должно создавать проблем интерпретации у грамотного специалиста.

1.3. Глубоко интронные мутации

Учитывая, что секвенирование полной белок-кодирующей последовательности гена у больных с клиническими признаками БШ не всегда позволяет выявить две мутации, необходимые для развития заболевания, было высказано предположение, что патогенные мутации в гене ABCA4 могут располагаться не только в экзонах и на экзон-интронных границах, но и глубоко в интронах [5, 6]. Поэтому в последние годы особенное внимание уделяют глубоко интронным мутациям ABCA4, которые могут генерировать новые сайты сплайсинга, конкурирующие с нормальными сайтами, нарушая процессинг мРНК. Так, в исследовании T. Braun и соавт. (2013) при секвенировании интронов 30, 32, 36 и 45 гена АВСА4 у пациентов с БШ выявлены глубоко интронные мутации, условно обозначенные как V1—V7: c.5196+1137G>A (V1), c.5196+1216C>A (V2), c.5196+1056A>G (V3), c.4539+2001G>A (V4), c.4539+2028C>T (V5), c.6342G>A (V6), c.4773+3A>G (V7) [5]. Позже были идентифицированы еще два глубоко интронных варианта ABCA4: c.5196+1136C>A (Vg1) и c.5196+1159G>A (Vg2) [6]. Вариант V1 неоднократно упоминается в литературе. Так, в голландской выборке пациентов с БШ, у которых была выявлена только одна экзонная мутация, V1 выявлен в 2 из 45 случаев [7]; в бельгийской выборке БШ с одной экзонной мутацией или без выявленных мутаций — у одного из 131 пациента [6].

Субстратом для патогенных глубоко интронных мутаций в АВСА4 служат слабо экспрессирующиеся в нормальной сетчатке минорные экзоны. Генетические варианты на границах минорных экзонов могут усиливать сплайсинг, приводя к включению этих экзонов в значительную часть молекул зрелой мРНК, повышая тем самым долю дефектных молекул, т.е. действуя как патогенные мутации. Слабо экспрессирующиеся в норме минорные экзоны были описаны T. Braun и соавторами в 2013 г. [5] по результатам ультраглубокого секвенирования РНК из образцов нормальной сетчатки человека. При формировании панелей NGS для поиска мутаций в гене АВСА4 целесообразно включать в дизайн области минорных экзонов гена. Список таких областей известен, и нет предпосылок к его изменению, поскольку он основан на наблюдении нормального сплайсинга в образцах здоровой сетчатки глаза человека.

Описанные выше принципы ДНК-диагностики гарантируют эффективное выявление патогенных вариантов ABCA4 в подавляющем большинстве случаев. Тем не менее следует учитывать ограничения в выявлении глубоко интронных мутаций вне нормальных минорных экзонов. В настоящее время такая возможность реализуется либо полногеномным секвенированием, либо таргетным секвенированием всех интронов гена ABCA4. Последний подход был реализован совсем недавно, и результаты его использования опубликованы в 2019 г. [8]. Авторы исследовали 5 ранее не описанных глубоко интронных генетических вариантов, приводящих к образованию новых псевдоэкзонов. Несмотря на то что патогенность новых вариантов окончательно не доказана, эта работа пионерски прокладывает путь к совершенствованию диагностики БШ и наиболее полному генотипированию пациентов с БШ, которое является основой (наряду с детальным офтальмологическим обследованием) адекватной оценки клинико-генетических корреляций.

1.4. Протяженные делеции и инсерции/дупликации

Согласно базе данных HGMD Professional 2021.1 (дата обращения: 04.05.21), к настоящему времени в гене ABCA4 описаны 23 протяженные делеции и 9 протяженных инсерций/дупликаций. Такого рода генетические варианты эффективно выявляют методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA). Не исключено, что современная оценка частоты протяженных повреждений гена ABCA4 занижена, поскольку метод MLPA используют при генотипировании больных с ABCA4-ассоциированными заболеваниями не во всех лабораториях. Очевидно, что для полного генотипирования использование метода MLPA необходимо.

2. Клинические и клинико-генетические корреляции при ABCA4-ассоциированных заболеваниях; интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.1. Клинические корреляции

Для выявления наследственных заболеваний сетчатки (НЗС), количественной и качественной оценки морфофункциональных характеристик нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза применяют ряд современных технологий: это спектральная оптическая когерентная томография, которая позволяет детально изучать слои сетчатки с высокой степенью разрешения, определять степень их повреждения, варьирующую от начальной дезорганизации фоторецепторов до полной потери этого слоя в макулярной области и атрофии подлежащего пигментного эпителия; аутофлюоресценция глазного дна, обеспечивающая визуализацию зоны атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и накопления липофусцина. Комплексное применение современных методик компьютерной периметрии, различных модификаций электроретинографии повышает возможности функциональных методов исследования [9].

Морфологические и функциональные исследования позволяют получить наиболее полную клиническую картину, оценить тяжесть фенотипа НЗС. В нашем исследовании у пациентов с мутациями в гене ABCA4 и длительностью заболевания более 5 лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев.

Было выявлено, что тяжесть фенотипа в небольшой степени зависит от длительности заболевания (К=0,27, p<0,05). Более значимая обратная корреляция была выявлена между тяжестью фенотипа и возрастом начала заболевания (K=–0,42, p<0,05). Так, раннее начало НЗС (до 10 лет) отмечено у 80% пациентов с тяжелым фенотипом в отличие от 26% пациентов с легким фенотипом и 33% со среднетяжелым фенотипом. Тем не менее выявленная корреляция между тяжестью фенотипа и возрастом дебюта заболевания является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения БШ при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение НЗС с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания. В то же время при длительности заболевания более 21 года у 9 (47%) из 19 пациентов с легким фенотипом сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС.

2.2. Интерпретация клинической значимости мутаций в гене ABCA4

2.2.1. Миссенс-мутации в гене ABCA4

Большинство генетических вариантов гена ABCA4 представляют собой миссенс-мутации (missense, т.е. с изменением «смысла», — замены нуклеотидов, приводящие к изменению одной аминокислоты на другую), многие из которых редко выявляются как среди пациентов с НЗС, так и в контрольных популяционных выборках, что осложняет интерпретацию клинической значимости этих генетических вариантов. Размеры выборок обследованных больных с конкретным редким вариантом до сих пор не позволяют определять степень его патогенности на основе статистических данных. В этой ситуации наиболее объективным методом определения степени патогенности является анализ влияния на функцию белка ABCA4. Одно из наиболее значимых исследований, проведенных в этом направлении, опубликовано H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]. Авторы исследовали 33 миссенс-мутации, 3 небольшие делеции без сдвига рамки считывания и одну небольшую делецию со сдвигом рамки считывания (рис. 3).

Рис. 3. Трансмембранная топография и доменная структура белка ABCA4 (из работы H. Sun, P.M. Smallwood, J. Nathans [10]).

Цитозольные домены изображены в нижней части рисунка. NBD (nucleotide binding domain) — нуклеотид-связывающий домен; HH (highly hydrophobic domain) — высокогидрофобный домен. A, B и C — мотивы последовательности аминокислот в нуклеотидсвязывающих складках. Отмечено расположение мутаций, для которых был проведен функциональный анализ в работе [10].

На первом этапе исследования стабильность молекул белка ABCA4, синтезированных на основе различных мутантных вариантов гена, оценивали методом иммуноблотинга. Значительное снижение количества белка отмечено при миссенс-мутациях, приводящих к аминокислотным заменам в трансмембранных доменах ABCA4.

На втором этапе оценивали эффективность АТФ-связывающей функции белка ABCA4, необходимой для осуществления его транспортной роли, для чего использовали меченный радиоактивным изотопом фосфора α-32P азидо-АТФ. Этот тест показал, что среди мутаций, не нарушающих продукцию белка, встречаются такие, которые приводят к синтезу белка с нарушенной функцией связывания АТФ. Среди них не только мутации, затрагивающие нуклеотид-связывающие домены, но и те, что приводят к аминокислотным заменам в других участках белка, например L541P и W1408R, расположенные вблизи трансмембранных доменов. Что же касается мутаций в нуклеотид-связывающих доменах (T971N, L1971R, G1977S и E2096K), то они становятся причиной практически полной потери функции связывания АТФ белком ABCA4.

Несмотря на то что в спектре молекулярных повреждений гена ABCA4 у больных НЗС преобладают миссенс-мутации, прочие типы мутаций также встречаются в этой группе больных, и интерпретация их клинической значимости также требует в ряде случаев использования лабораторных экспериментальных подходов для определения характера влияния на структуру и функцию измененного гена.

2.2.2. Нуль-мутации в гене ABCA4

Наименьшие сложности возникают при интерпретации генетических вариантов, приводящих к формированию нуль-аллелей, т.е. полностью нефункционирующих аллелей. К нуль-мутациям относятся большинство нонсенс-мутаций, короткие инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания, изменения инициирующего кодона, делеции/дупликации одного или нескольких экзонов, изменения канонических нуклеотидов сайтов сплайсинга [11]. Однако, как показывают результаты недавно опубликованных исследований, эффекты мутаций сайтов сплайсинга могут оказаться непредсказуемыми и выходящими за рамки привычных представлений [8]. С другой стороны, накапливается информация о генетических вариантах, которые могут изменять сплайсинг мРНК ABCA4, располагаясь вне канонических сайтов сплайсинга [8].

Эффект мутаций сайта сплайсинга может варьировать от незначительной до полной утраты функции белка. Анализ таких мутаций — сложная задача из-за отсутствия экспрессии мРНК АВСА4 в легкодоступных клетках лимфоцитов периферической крови. В подобных случаях для характеристики эффекта мутаций сайта сплайсинга используют модели сплайсинга in vitro. В таких моделях изменения сплайсинга изучают на коротких фрагментах генома (мини-генах), несущих изучаемые генетические варианты. Для создания мини-гена изучаемый участок генома, полученный амплификацией методом ПЦР, клонируют в плазмидный вектор и трансфицируют в культивируемые клетки. Трансфицированные клетки выращивают, после чего проводят экстракцию из них РНК. Далее используют полученную РНК как матрицу для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) методом обратной транскрипции. Полученные молекулы кДНК анализируют секвенированием по Сэнгеру [12].

Использование мини-генов позволило установить патогенность целого ряда генетических вариантов, расположенных вблизи сайтов сплайсинга гена АВСА4. Так, было показано, что варианты c.4773+3A>G, c.67-1G>C, c.1239+1G>C, c.4352+1G>A и c.5461-10T>C приводят к пропуску экзонов АВСА4 [12, 13]. Для ряда других вариантов АВСА4 (c.160+2T>C, c.2160+1G>T, c.5018+2T>C, c.5196+1G>A, c.3813G>A) анализ транскрипции в мини-генах показал аномальное включение интронов в состав транскриптов [13].

Некоторые авторы считают мини-гены недостаточно адекватной модельной системой для точной характеристики функциональных последствий генетических вариантов, нарушающих сплайсинг. В качестве альтернативы мини-генам предлагаются мидигены, сохраняющие интактным геномный контекст, в частности соседние экзоны и цис-регуляторные элементы, влияющие на распознавание экзонов [14]. С помощью системы мидигенов уже проведен функциональный анализ всех неканонических потенциально патогенных вариантов сайтов сплайсинга, описанных у пациентов с БШ на 2017 г. Несмотря на то что все изученные варианты подробно охарактеризованы авторами с точки зрения влияния на структуру транскриптов, главной обобщающей метрикой, отражающей степень патогенности мутаций, явилась доля остаточной нормальной мРНК АВСА4 (рис. 4). Порогом патогенности генетического варианта принято значение остаточной концентрации нормального транскрипта, равное 79,6% [14].

Рис. 4. Значения остаточной концентрации нормального транскрипта ABCA4 для неканонических вариантов сайтов сплайсинга [14].

На сегодняшний день функциональный анализ влияния на сплайсинг мРНК ABCA4 проведен не менее чем для 100 генетических вариантов. Однако многообразие подобных вариантов значительно шире, и задача их характеристики, в том числе в разрезе клинико-генетических корреляций, остается крайне актуальной.

2.3. Особенности клинического течения НЗС при различных типах мутаций в гене АВСА4

Поскольку мутации АВСА4 могут быть причиной различных НЗС, многие исследователи пытаются объяснить широкий спектр заболеваний, вызванных мутациями в ABCA4, и построить модели генотип-фенотипической корреляции. Согласно упрощенной модели, у пациентов с двумя тяжелыми мутациями развивается пигментная абиотрофия (ПА), у пациентов с одной тяжелой и одной умеренной мутацией — палочко-колбочковая дистрофия (ПКД), у пациентов с одной тяжелой и одной мягкой мутацией — БШ, пациенты с одной тяжелой или умеренной мутацией находятся в группе повышенного риска по возрастной макулярной дегенерации (ВМД).

Концепция мягких, умеренных и тяжелых мутаций предложена группой Ф. Кремерса [15] вскоре после того, как был картирован ген АВСА4 и доказана роль его повреждений в этиологии НЗС. Авторы концепции предположили, что большинство мутаций ABCA4 можно отнести к тому или иному классу патогенности и что в зависимости от остаточной общей активности белка ABCA4 возможно развитие патологического фенотипа в спектре от ВМД (наиболее легкий фенотип) до ПА (наиболее тяжелый фенотип). Предполагалось, что эта модель позволит прогнозировать тяжесть заболевания на основе тяжести мутаций ABCA4 (рис. 5). Было постулировано, что при наличии двух нуль-мутаций ABCA4 (черные прямоугольники на рис. 5) неизбежно развивается ПА. Клинически более легкие фенотипы ПКД и БШ ассоциированы с комбинациями мутаций, приводящих к частичной инактивации белка ABCA4. Таким образом, генотипы БШ включают в себя либо две умеренные мутации (серые прямоугольники на рис. 5), либо одну тяжелую и одну мягкую мутацию, например p.G863A (в белых прямоугольниках на рис. 5).

Рис. 5. Классификатор клинической значимости генетических вариантов ABCA4, заложивший основу современной концепции мягких/умеренных/тяжелых мутаций и их ассоциации с различными клиническими формами дистрофии сетчатки (адаптировано из [15]).

Вышеизложенную гипотезу подтверждает множество клинических примеров. Например, описана семья с близкородственным браком, в которой две нуль-мутации ABCA4 (сайта сплайсинга IVS30+1G>Т (c.4539+1G>T) в гомозиготном состоянии) привели к развитию пигментной абиотрофии у 4 пациентов; тяжелая мутация сайта сплайсинга IVS30+1G>T и умеренная IVS40+5G>А (c.5714+5G>A) были выявлены у 5 родственников с ПКД, две умеренные мутации или мягкая и тяжелая мутации, такие как IVS30+1G>T и с.2588G>C (мягкая мутация), были обнаружены у 2 родственников с БШ. При этом вывод о том, что c.5714+5G>A является умеренной, был сделан исключительно на основании анализа фенотипов в исследованной родословной. Авторы отмечали, что полученные клинико-генетические корреляции позволяют судить о тяжести мутаций, однако уверенно предсказать эффект мутации c.5714+5G>A на мРНК и белок ABCA4 можно только после детального анализа сплайсинга РНК. Спустя 20 лет функциональный анализ этой мутации, проведенный той же группой исследователей, подтвердил предположение о степени патогенности, ранее сделанное на основании клинических данных: для c.5714+5G>A определена остаточная концентрация транскрипта на уровне 40% (см. рис. 4) [15].

Для большого числа наследственных патологий клиническая гетерогенность на фоне одинаковых мутаций может быть обусловлена сложным многоэтапным и разветвленным молекулярным этиопатогенезом этих заболеваний. В случае ABCA4-ассоциированных наследственных форм атрофии сетчатки отмечена очень короткая этиопатогенетическая цепочка, вызывающая манифестацию и прогрессию клинических фенотипов. Можно предположить, что именно эти заболевания следуют простейшей модели, в которой будет эффективен не только прогноз заболевания на основании наличия у обследуемого известных мутаций в гене ABCA4, но и обратное — отнесение впервые обнаруженных мутаций к той или иной категории тяжести на основании только клинической картины. Приведенная выше мутация c.5714+5G>A подтверждает это. Возможность двунаправленной валидации клинико-генетических корреляций должна способствовать достижению максимальной эффективности генотипирования пациентов с ABCA4-ассоциированными болезнями, что крайне важно с точки зрения назначения генной терапии в будущем: случаи, когда клинические проявления не соответствуют предсказаниям базовой модели, должны становиться объектом более пристального генотипирования, например с использованием технологий полногенного или полногеномного секвенирования.

3. Генотипирование пациентов с ABCA4-ассоциированными заболеваниями как основа персонификации терапии

До недавнего времени наследственные формы дистрофии сетчатки считались неизлечимыми заболеваниями. Сегодня большие надежды на возможность лечения этой группы заболеваний связывают с генотерапевтическими подходами. Многообещающие результаты показали недавние доклинические и продолжающиеся клинические испытания ¹/₂ фазы с использованием технологий доставки здоровых генов для лечения некоторых форм синдрома Ашера и пигментного ретинита (ClinicalTrials.gov; NCT02065011). Однако в терапии наиболее распространенной моногенной формы наследственной дистрофии сетчатки — болезни Штаргардта такой подход затруднен из-за значительного размера кодирующей последовательности гена ABCA4. Альтернатива доставке здоровых генов в сетчатку — редактирование мутаций, приведших к заболеванию, например с помощью CRISPR/Cas9. Такой подход реализован в доклинических испытаниях, однако протоколы пока далеки от использования в клинической практике.

Перспективным подходом к генотерапии ABCA4-ассоциированных заболеваний сетчатки можно рассматривать использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), которые представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов) одноцепочечные синтетические молекулы РНК, сконструированные так, чтобы избирательно связываться с комплементарной мРНК-мишенью. Связывание АСО с РНК может изменить сплайсинг пре-мРНК. АСО-коррекция дефектов сплайсинга, возникающих как следствие глубоких интронных мутаций, теоретически может быть эффективной для лечения больных с ABCA4-ассоциированными НЗС, у которых один из аллелей ABCA4 поврежден глубоко интронной мутацией [16]. Доставка АСО в сетчатку считается безопасной и хорошо переносимой, что показали результаты недавнего клинического исследования ¹/₂ фазы по коррекции распространенного глубоко интронного варианта гена CEP290 при врожденном амаврозе Лебера [17].

Важным и необходимым этапом разработки подходов к АСО-терапии является максимально полное генотипирование (включая интронные последовательности) выборок пациентов для постановки точных молекулярно-генетических диагнозов и определения конкретных дефектов генов, подлежащих функциональной коррекции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.