В последние годы активно проводятся исследования патогенетических механизмов развития глаукомы. Доказано, что различные системные факторы, такие как гиперлипопротеинемия и окислительный стресс, могут способствовать возникновению и усилению тяжести глаукомного повреждения [1—4]. Однако результаты некоторых исследований противоречивы. Так, в ряде работ доказано, что люди, у которых показатели липидного обмена превышают референсные значения возрастной нормы, имеют более высокий риск развития первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ) [5, 6], а показатели распространенности гипертензии и высокого уровня триглицеридов были выше у пациентов с глаукомой, чем без нее [7, 8]. X. Song и соавт. [9] выявили внутреннюю связь между атеросклерозом и глаукомой.
Окисление липидов является естественным метаболическим процессом, необходимым для роста клеток любого типа. Превышению нормальных концентраций окисленных липопротеинов препятствуют защитные антиокислительные клеточные механизмы. Повышенное образование окисленных липопротеинов вызывает снижение антиоксидантного потенциала плазмы, активацию перекисного окисления липидов (ПОЛ), в результате чего развивается окислительный стресс. Неконтролируемое ПОЛ — основной путь химической трансформации липопротеинов [10]. Липиды «атерогенной» фракции — липопротеины низкой плотности (ЛПНП), которые захватываются и удерживаются молекулами протеогликанов интимы артериальной стенки, — подвержены перекисной модификации в наибольшей степени.
Считается, что одним из основных ферментов крови, осуществляющих гидролиз окисленных липидов в составе липопротеинов, является кальций-зависимая гидролаза параоксоназа 1 (PON1), которая обладает значительным антиоксидантным действием. PON1 в сыворотке крови находится в связанном состоянии с липопротеинами высокой плотности (ЛПВП). Было установлено, что PON1 снижает уровень окислительной модификации ЛПНП in vitro, осуществляя гидролиз окисленных липидов. Кроме того, PON1 защищает и сами ЛПВП от окисления, позволяя сохранять их антиатерогенные свойства [11, 12].
PON1 может инактивироваться при выраженном окислительном стрессе, вызванном воспалением [13], что еще сильнее ухудшает функцию ЛПВП. При некоторых патологических состояниях (инфаркт миокарда, сахарный диабет 2-го типа, семейная гиперхолестеринемия) активность PON1 снижена. На практике низкая активность PON1 связана с ухудшением прогнозов сердечно-сосудистых заболеваний, и было обнаружено, что она снижается при различных воспалительных [14] и инфекционных [15] заболеваниях. Интрелейкин-10, который при определенных обстоятельствах может выступать как провоспалительный цитокин, также способен снижать уровень ЛПВП в плазме за счет увеличения микропиноцитоза [16].
Наблюдается значительная вариабельность в отношении активности PON1 у разных индивидуумов. Гистограммы распределения частот позволили выявить три различных фенотипа, соответствующих высокой, промежуточной и низкой активности PON1 в сыворотке крови. Ряд исследований свидетельствуют о возможном расхождении между концентрацией фермента и его активностью [17]. В связи с этим очень важны исследования, направленные на выявление генетически запрограммированной системы поддержания баланса структуры и функции липопротеинов для предотвращения их модификации, в результате которой они приобретают проатерогенные свойства.
Группа ученых во главе с T. Bhattacharyya [18] доказала связь между генетическими детерминантами и активностью фермента PON1, с одной стороны, и развитием системного окислительного стресса — с другой, что указывает на потенциальную роль PON1 в защите сосудов от атеросклероза. Результаты предварительных исследований свидетельствуют, что повышение активности белка PON1 приводит к снижению риска возникновения атеросклероза [19].
В офтальмологии проводились исследования баланса окислителей/антиоксидантов, фенотипов PON1, связанной с ЛПВП, и уровней обычных липидов в сыворотке крови у пациентов с глаукомой псевдонормального давления и псевдоэксфолиативной глаукомой по сравнению со здоровыми лицами, вошедшими в контрольные группы [20]. Было установлено, что выраженность окислительного стресса и сниженная активность PON1 наблюдались в группе пациентов с глаукомой псевдонормального давления, а PON1 является ключевым элементом функции ЛПВП с учетом метаболизма липидов и окислительного стресса повреждения.
Полиморфизм в гене PON1 существенно влияет на каталитическую способность фермента. Однонуклеотидный полиморфизм этого гена, приводящий к изменению активности параоксоназы, представляет собой несинонимическую замену Q192R SNP в Region Ex6+ 78A>G [GenBank: https://www.ncbi.nlm.nih.gov]. Эта замена связана с продукцией двух аллоферментов, различающихся аминокислотными остатками: глутаминовый (Q) или аргининовый (R) — в позиции 192 активного центра фермента [21].
На данный момент хорошо изучены полиморфизмы кодирующей области гена PON1 L55M (rs854560) и Q192R (rs662). Установлено, что изоформа белка Q192 обладает значительно сниженной параоксоназной активностью и осуществляет гидролиз нефизиологического субстрата параоксона менее эффективно, чем изоформа 192R. Было выявлено, что благодаря своей липолактоназной активности PON1 может осуществлять гидролиз окисленных фосфолипидов плазматической мембраны макрофагов с образованием липолактонов, являющихся модуляторами местного воспалительного процесса и стимуляторами обратного транспорта холестерина. Также было выявлено, что уровень лактоназной активности PON1 тоже различается между двумя белковыми изоформами — Q192 и 192R.
Некоторые экзогенные факторы могут модулировать активность PON1 и/или уровень экспрессии гена. На уровень активности фермента PON1 могут оказывать влияние физическая активность, отказ от курения, диета. В исследованиях последних лет было обнаружено, что некоторые вещества повышают активность фермента PON1 и улучшают здоровье сердца. Подобно изменениям в питании, эти ингредиенты в первую очередь повышают PON1, действуя как антиоксиданты [22, 23].
Отечественный препарат «Цитофлавин» является метаболическим цитопротектором, антигипоксантом, антиоксидантом и энергокорректором, стимулирующим синтез белка внутри клеток и участвующим в процессе быстрой утилизации жирных кислот. В ряде экспериментальных [24] и клинических работ [25] изучалось гиполипидемическое и антиоксидантное действие цитофлавина при дислипидемии, сопровождающей метаболический синдром, алиментрное ожирение, неалкогольную жировую болезнь печени, острый инфаркт миокарда.
Цель исследования — генотипирование по полиморфизму Q192R гена PON1 пациентов с ПОУГ для выяснения генетической предрасположенности к дислипидемии и атеросклерозу, а также определение возможности коррекции сниженной активности фермента PON1 у обследованных лиц комплексным препаратом Цитофлавин.
Материал и методы
По полиморфизму Q192R гена PON1 генотипированы 25 мужчин европеоидной расы (средний возраст 63,0±5,4 года) с ПОУГ (развитая стадия, внутриглазное давление компенсировано гипотониками) и 20 добровольцев соответствующего возраста без ПОУГ. Полиморфизм гена PON1 определяли с помощью анализатора — секвенатора ДНК PyroMark Q24 (QIAGEN GmbH, Германия) методом пиросеквенирования. Полиморфизм кодирующего региона PON1-Q192R определяет субстрат-зависимый эффект на активность. Активность PON1 измерялась в плазме крови относительно субстрата параоксон (Sigma) на спекрофотометре SmartSpecTMPlus (BioRad, США) согласно лицензированной методике [27]. Активность PON1 оценивали по скорости образования нитрофенола при добавлении параоксона, разведенного в ацетоне, к плазме крови. Конечная концентрация параоксона в реакционной смеси (100 ммоль/л трис-HCl, pH=8,0; 2 ммоль/л CaCl2) составляла 12 ммоль/л. За 1 единицу активности принимали 1 нмоль нитрофенола, образующийся в 1 мин на 1 мл плазмы.
Схема терапии Цитофлавином включала внутривенное капельное введение раствора в объеме 10 мл в 200 мл 0,9% раствора изотонического раствора натрия хлорида ежедневно, курс 10 дней, затем амбулаторно перорально по 2 таблетки 2 раза в сутки в течение 25 дней (100 таблеток на курс лечения).
Статистическая обработка результатов исследования проводилось в пакетах программ для статистического анализа Statistica 10.0 и IBM SPSS Statistics 21.0. Для описания количественных данных применялись методы описательной статистики с вычислением среднего значения и стандартного отклонения (М±m), медианы и интерквартильного размаха (Me [25-й; 75-й перцентили]), для проверки количественных данных на нормальность распределения применялся критерий Колмогорова—Смирнова. Значимость различий количественных показателей между двумя независимыми группами оценивалась с использованием U-критерия Манна—Уитни или t-критерия Стьюдента в зависимости от распределения данных. Количественную оценку связи двух признаков оценивали с помощью отношения шансов и его 95% доверительного интервала (ДИ). Расчет отношения шансов осуществлялся на основе таблиц сопряженности или с использованием бинарной логистической регрессии. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05 (значение p<0,05).
Результаты
С точки зрения ферментативной активности PON1 сыворотки крови человека присутствует в двух основных полиморфных формах варьирующих в положении аминокислоты 192, а именно замещение глутамина (Q) на аргинин (R) в кодоне 192 (рис. 1).
Рис. 1. Схема наиболее распространенных полиморфизмов кодирующей области гена PON1 — L55M (rs854560) и Q192R (rs662).
Генетический полиморфизм Q192R отвечает за три фенотипа: QQ, QR и RR — для низкой, средней и высокой активности PON1 соответственно. Фенотипическое распределение активности PON1 у пациентов с глаукомой и здоровых лиц контрольной группы представлена в табл. 1.
Таблица 1. Фенотипическое распределение активности PON1 у пациентов с ПОУГ и добровольцев контрольной группы без глаукомы
| Группы сравнения | Фенотип | p | ||
| | QR | RR | ||
| ПОУГ (n=25) | 57,5% (n=14) | 36,3% (n=9) | 5,9% (n=2) | <0,001 |
| Активность PON1 (ед. акт.) | 24,05±1,17 | 27,41±1,51 | 29,35±1,21 | |
| Группа контроля (n=20) | 40,7% (n=8) | 51,5% (n=10) | 8,2% (n=2) | <0,05 |
| Активность PON1 (ед. акт.) | 26,32±2,34 | 27,54±1,51 | 29,57±1,21 | |
| ОР, 95% ДИ показателя ОР | 1,41±0,12 [1,01-2,61] | –1,41±0,21 [1,11-1,6] | –1,39±0,15 [0,37 1,23] | <0,001 |
Примечание. ОР — относительный риск клинически значимого атеросклеротического повреждения.
При сопоставлении уровня активности PON1 между носителями различных генотипов у всех обследованных лиц выяснилось, что фенотип QQ (низкая активность) оказался более доминирующим в группе пациентов с ПОУГ по сравнению с контрольной группой, а фенотип QR (средняя активность) преобладал в группе добровольцев соответствующего возраста без глаукомы (рис. 2).
Рис. 2. Соотношение фенотипов по полиморфизму Q192R в группах сравнения.
Активность PON1 была минимальной у носителей генотипа QQ192 и максимальной у носителей генотипа RR192, как среди пациентов с ПОУГ, так и в контрольной группе. Значимые отличия активности PON1 получены у пациентов с ПОУГ — носителей QQ192 по сравнению с носителями QR192 (p<0,001); QQ192 по сравнению с RR192 (p<0,001); QR192 по сравнению с RR192 (p<0,001), а в контрольной группе — также у носителей QQ192 по сравнению с QR192 (p<0,05); QQ192 по сравнению с RR192 (p<0,05); QR192 по сравнению с RR192 (p<0,05; рис. 3).
Рис. 3. Активность PON1 у носителей различных генотипов в группах сравнения.
Риск возникновения клинически значимого атеросклеротического повреждения при ПОУГ для гомозиготы QQ в среднем в 1,41 раза выше, а для гетерозиготы QR — в 1,4 раза ниже, чем у лиц того же возраста без глаукомы. Для гомозиготы RR отмечена тенденция к снижению риска атеросклеротического повреждения в 1,39 раза, хотя из-за небольшого числа наблюдений данная тенденция статистически незначима.
Пациентам групп сравнения (разных фенотипов) был назначен комплексный препарат «Цитофлавин» по схеме, приведенной в разделе «Материал и методы». Изменение активности фермента PON1 у пациентов с генетическим полиморфизмом Q192R после курса лечения представлено в табл. 2.
Таблица 2. Динамика активности (ед. акт.) фермента PON1 у пациентов с генетическим полиморфизмом Q192R на фоне лечения
| Генотип | Основная группа, n=25 | p | Контрольная группа, n=20 | p | ||
| Исходно | Сразу после курса лечения | Исходно | Сразу после курса лечения | |||
| QQ192 | 24,05±1,17 | 24,8±2,26 | 0,08 | 26,32±2,34 | 26,58±2,34 | 0,09 |
| QR192 | 27,41±1,51 | 28,13±1,51 | 0,039 | 27,54±1,51 | 28,04±2,31 | 0,044 |
| RR192 | 29,35±1,21 | 30,13±3,02 | 0,024 | 29,57±1,21 | 29,92±2,16 | 0,051 |
На фоне лечения выявлено значимое улучшение активности фермента PON1 у пациентов фенотипов QR и RR и положительная тенденция повышения активности у гомозигот QQ в обеих группах сравнения.
Учитывая результаты наших предыдущих исследований (нормализация липидограммы, снижение выраженности окислительного стресса, повышение антиоксидантной способности сыворотки крови, улучшение функции сосудистого эндотелия у пациентов с ПОУГ) [4, 26], мы считаем целесообразным назначение препарата «Цитофлавин» всем пациентам с ПОУГ, особенно с выраженной предрасположенностью к развитию атеросклеротического повреждения и нарушению липидного обмена.
Обсуждение
Повышенную устойчивость к заболеваниям гетерозигот можно объяснить более разнообразным, чем у гомозигот, составом аллоферментов, которые проявляют активность по отношению к широкому спектру экзогенных и эндогенных факторов. Результаты настоящего исследования не противоречат данным подобных исследований при сахарном диабете, атеросклерозе, болезни Паркинсона, первичной глаукоме [20, 27—29]. Показано, что гидролизующая активность параоксоназы по отношению к ЛПВП максимальна у индивидов с генотипом PON1 RR192, а у индивидов с генотипом PON1 QQ192 эта активность в несколько раз ниже. Вместе с тем способность аллоферментов параоксоназы защищать ЛПНП от окисления полностью противоположна параоксонгидролизующей активности. Так, PON1 192R намного слабее защищала ЛПНП от пероксидации, чем PON1 192Q, что говорит о меньшей активности аллофермента PON1 R при метаболизировании липидных перекисей по сравнению с аллоферментом PON1 Q. Гетерозигота, таким образом, обладает более надежной защитой от комбинированного воздействия неблагоприятных факторов внешней и внутренней сред, большей адаптивностью, чем каждая из гомозигот. В свете этой информации становится понятно, почему гетерозиготы проявляют повышенную устойчивость к заболеванию.
В нашем предыдущем исследовании было доказано, что по мере прогрессирования ПОУГ снижаются эндогенные механизмы антиоксидантной защиты, ухудшается функция сосудистого эндотелия, активируются процессы атерогенеза на фоне дислипидемии и нарушения циркадной регуляции метаболического гемостаза [25].
Настоящее исследование подтвердило, что снижение эндогенных механизмов антиоксидантной защиты у пациентов с ПОУГ может быть связано с полиморфизмом Q192R гена PON1 и более низкой арилэстеразной активностью PON1. Гомозиготные носители аллеля 192R обладали значимо более низкими уровнями активности PON1, чем гомозиготные носители аллеля Q192. Носительство аллеля 192R может определять повышенный риск атеросклеротического повреждения у пациентов с ПОУГ, особенно на фоне высокого уровня атерогенных липопротеинов крови, низкого уровня ЛПВП или высокого уровня ПОЛ в крови.
В предыдущем исследовании мы обнаружили, что препарат «Цитофлавин» проявлял терапевтические эффекты в отношении окислительного стресса и гиперхолестеринемии у пациентов с ПОУГ. В настоящем исследовании мы убедились, что на фоне лечения меняется активность PON1 — фермента, который отвечает за защиту липопротеинов от пероксидации. Однако необходимы дальнейшие исследования для выявления ассоциаций между активностью PON1, липидными фракциями, показателями ПОЛ, выраженностью эндотелиальной дисфункции и прогрессированием ПОУГ у носителей разных генотипов по полиморфизму Q192R гена PON1.
Заключение
Чрезвычайно важным является дальнейшее изучение полиморфизмов гена PON1 для определения предрасположенности к дислипидемии и развитию атеросклероза у пациентов с ПОУГ как факторов риска эндотелиальной дисфункции и прогрессирования глаукомной оптической нейрооптикопатии. Патогенетически обоснованный подход к использованию Цитофлавина в комплексном лечении пациентов с ПОУГ и расширение доказательной базы эффективности сукцинатсодержащих препаратов, на наш взгляд, открывают перспективы для рассмотрения возможных альтернативных стратегий повышения уровня и активности PON1 и в целом совершенствования терапии у коморбидных пациентов с глаукомой.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Т.М.
Сбор и обработка материала: Ю.Ф., А.В.
Написание текста: Ю.Ф.
Редактирование: Т.М., С.П., Д.Г.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.