Прогностическая значимость клинико-антропометрических, биохимических, метаболических, сосудисто-воспалительных и молекулярно-генетических маркеров в развитии первого ишемического инсульта

На сегодняшний день в мире насчитывается около 9 млн больных с цереброваскулярными заболеваниями, основное место среди которых занимает ишемический инсульт (ИИ). Ежегодно И.И. поражает от 5,6 до 6,6 млн человек и уносит 4,6 млн жизней, смертность от цереброваскулярных заболеваний уступает лишь смертности от сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний и достигает в экономически развитых странах 11—12%. Ежегодная смертность от ИИ в Российской Федерации — одна из наиболее высоких в мире — 175 случаев на 100 тыс. населения. Наблюдаются омоложение инсульта и увеличение его распространенности у лиц до 65 лет. Показатели заболеваемости и смертности от инсульта среди лиц трудоспособного возраста в России увеличились за последние 10 лет более чем на 30% [1].

ИИ является сложным заболеванием с широко обсуждаемой сегодня его обусловенностью полифакторным наследственным компонентом, биохимическими, метаболическими, воспалительными, коагуляционными и гемодинамическими факторами, а также влияниями условий окружающей среды в местах проживания. Изучение особенностей возникновения ИИ в различных популяциях показало некоторые отличия [2]. Традиционные модифицируемые факторы риска ИИ — артериальная гипертония (АГ), фибрилляция предсердий, курение, заболевания сердца, атеросклеротический стеноз сонных и позвоночных артерий, атерогенная дислипидемия и сахарный диабет 2-го типа (СД2). К немодифицируемым факторам относят возраст, пол, наследственность, этническую принадлежность и перенесенный инсульт [1]. Для оценки риска развития первого ИИ для пациентов с фибрилляцией предсердий разработаны эффективные шкалы CHADS2 и CHA2DS2VASc, однако фибрилляция предсердий является причиной ИИ лишь в 15—20% случаев [3]. Для остальных пациентов оценка возможна только на основании расчета общего сердечно-сосудистого риска, включающего не только ИИ, но и другие события.

Проведенные исследования показали, что в развитии первого ИИ важную роль играют генетические факторы, контролирующие процессы коагуляции и тромбообразования, обмена липидов, активацию ренин-ангиотензиновой системы, функционирование антиоксидантной системы и т. д. [4, 5]. Однако, несмотря на многочисленные работы, направленные на поиск новых сочетаний полиморфизма генов, определяющих многофакторную предрасположенность к ИИ, задача еще далека от завершения. Проблема создания модели оценки риска развития первого ИИ заключается в том, что должны учитываться не только многочисленные факторы риска и существующие заболевания, но также генетические предикторы и условия жизни (местность, урбанизация).

В настоящее время ведется поиск новых генов и метаболических маркеров для оценки возможных ассоциаций с развитием ИИ [2—5]. Полиморфные варианты генов, таких как ген IL-8, адипонектина (ADIPOQ), рецептора адипонектина (ADIROR), аполипопротеина В (APOB), аполипопротеина С-IV (APOC-IV), мозгового нейротрофического фактора (BDNF), рецептора глутамата 3 (GRM3), отвечающих за липидный и углеводный обмен, сосудистое воспаление, эндотелиальную дисфункцию и нейротрансмиттерную функцию, рассматриваются как перспективные, однако до настоящего времени они не были изучены в комплексе с клиническими, антропометрическими, биохимическими, метаболическими факторами, а также маркерами сосудистого воспаления и эндотелиальной дисфункции, в однородной группе, на предмет возможной ассоциации с развитием первого ИИ.

Цель настоящего исследования — изучение взаимосвязи между основными клиническими, антропометрическими, биохимическими и метаболическими параметрами, маркерами сосудистого воспаления и эндотелиальной дисфункции, полиморфными вариантами генов IL-8, ADIPOQ, ADIROR, APOB, APOC-IV, BDNF, GRM3 и развитием первого ИИ, а также разработка прогностической модели для определения вероятности возникновения первого ИИ.

Материал и методы

В исследование случай—контроль были включены 315 человек. Основную группу составили 196 больных, перенесших первый ИИ и поступивших на лечение в неврологические стационары Центра патологии речи и нейрореабилитации Москвы. В контрольную группу вошли 119 пациентов, соответствующих по возрасту больным основной группы, которые проходили в то же время профилактические осмотры в районных и ведомственных лечебно-профилактических учреждениях Москвы и не переносили ИИ или черепно-мозговую травму.

Критерии включения: русская национальность, возраст от 25 до 80 лет, проживание в Москве более 20 лет.

Критерии исключения: наличие подтвержденных семейных моногенных форм заболеваний, предрасполагающих к развитию ИИ (болезнь Фабри, синдромы Марфана и Элерса—Данлоса, тип IV, CADASIL и т. д.), фибрилляция предсердий, врожденные и приобретенные пороки сердца и клапанов, беременность, алкоголизм и наркомания, острые или хронические психиатрические заболевания, терминальные состояния, участие пациента в любом другом исследовании в течение последних 30 дней.

Верификация ИИ в основной группе осуществлялась в специализированном неврологическом отделении с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ). Невролог проводил осмотр пациентов обеих групп. На каждого включенного в исследование заполнялось досье с основной информацией о месте рождения и постоянного проживания, этнической самоидентификации, перенесенных заболеваниях, травмах, операциях, статусе курения, употреблении алкоголя и наркотических веществ, наследственном анамнезе по инсульту и другим сердечно-сосудистым заболеваниям, наследственным соматическим и психическим заболеваниям. Исследование выполнено в соответствии с Хельсинской декларацией (Финляндия, 1964 г.), пересмотренной в октябре 2000 г. (Шотландия). Все участники исследования подписывали информированное согласие.

Материалом для оценки биохимических, метаболических параметров, а также маркеров сосудистого воспаления и эндотелиальной дисфункции являлась сыворотка или плазма, для генетического исследования — цельная кровь пациентов. Определение биохимических параметров проводили в сыворотке или плазме, полученной стандартными методами из венозной крови, взятой после 12-часового голодания.

Содержание общего холестерина (ОХС, ммоль/л), триглицеридов (ммоль/л), липопротеинов низкой плотности (ЛПНП, ммоль/л), липопротеинов высокой плотности (ЛПВП, ммоль/л), аполипопротеина А1 (Аро А1, г/л), аполипопротеина В (Аро В, г/л) в сыворотке крови определяли с помощью ферментных наборов фирмы «BioSystems» (Испания) на автоматическом биохимическом анализаторе с ионселективным блоком Ilab 650 («Shimadzu Corporation Instrumentation Laboratory», Италия). Содержание иммунореактивного инсулина (пмоль/л) в плазме крови определялось натощак с использованием наборов Ultrasensitive Insulin («Beckman Coulter, Inc.», США) на автоматическом иммунохимическом анализаторе Access-2 («Beckman Coulter, Inc.», США). Содержание адипонектина (мкг/мл), цистатина С (мг/мл) в плазме крови определяли натощак с использованием наборов BioVendor (Швеция) на микропланшетном фотометре 3-го поколения Ридер УНИПЛАН-9213 (ЗАО «ПИКОН», Россия). Концентрацию N-концевого пропептида натрий уретического гормона (NT-proBNP, пг/мл), IL-1β, IL-10, IL-8, IL-4, IL-6 (пг/мл), фактора некроза опухолей альфа (ФНО-α, пг/мл), фактора роста сосудистого эндотелия, А (VEGF А, пг/мл) в плазме крови определяли натощак с использованием наборов ИФА («Вектор-Бест», Россия) на микропланшетном фотометре 3-го поколения Ридер УНИПЛАН-9213 (ЗАО «ПИКОН», Россия). Содержание глюкозы (ммоль/л), креатинина (мкмоль/л), мочевой кислоты (мкмоль/л), высокочувствительного С-реактивного белка (СРБ—всч, мг/л) в сыворотке крови определялось натощак с использованием наборов BioSystems (Испания) на автоматическом биохимическом анализаторе с ионселективным блоком Ilab 650 («Shimadzu Corporation Instrumentation Laboratory», Италия). Определение уровня гомоцистеина проводилось с использованием набора Hemosil («Instrumentation Laboratory», Италия) на автоматическом анализаторе гемостаза ACL 9000 («Instrumentation Laboratory», США).

Всем участникам исследования проводился забор крови для генотипирования по методике J. Hixson и D. Vernier [6]. Выделение геномной ДНК из крови производили, используя метод магнитных частиц, на автоматизированной системе для экстракции нуклеиновых кислот Chemagen Prepito («ABBIS», Германия). Для типирования SNPs (однонуклеотидные полиморфные варианты, однонуклеотидные полиморфизмы) производили анализ распознавания аллелей методом полимеразной цепной реакции с использованием готовых зондов TaqMan, имеющих идентификационный номер Assey ID («Applied Biosystems», США). Амплификацию полиморфных участков исследуемых генов проводили на амплификаторе 7500 Real-Time PCR System («Applied Biosystems», США). Условия амплификации были стандартные и соответствовали указанным поставщиком реагентов для каждого Assey ID. Обозначения генотипов даны в соответствии с международной базой данных db SNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/).

Для статистической обработки данных применяли программу SPSS 20.0. Уровень значимости принимали равным p<0,05. Проверку на нормальность распределения проводили с помощью W-критерия Шапиро—Уилка и критерия Колмогорова—Смирнова с поправкой Лиллиефорса, гистограмм распределения. Для сравнения выборок, удовлетворяющих критериям нормального распределения, использовали t-критерий Стьюдента для независимых величин, равенство дисперсий проверялось по критерию Ливиня. Переменные представляли в виде M±SD, где М — среднее арифметическое, SD — стандартное отклонение. В случае непараметрического распределения для сравнения выборок использовали U-критерий Манна—Уитни. Переменные представляли в виде Me [Q25; Q75], где Мe — медиана, Q25 и Q75 — нижний и верхний квартили. Сравнение частот номинальных данных проводилось с использованием критерия χ² или точного критерия Фишера (в случае значения частоты меньше 5 в одной из клеток таблицы

Таблица 1. Основные демографические и клинико-антропометрические параметры пациентов обеих групп Примечание. Данные представлены в виде M±SD (если не указано иное), где М — среднее значение, SD — стандартное отклонение. ¹— критерий χ².

2×2) c поправкой Йетса. Распределение аллелей и генотипов проверяли на отклонение от равновесия Харди—Вайнберга. Корреляцию оценивали по методу ранговой корреляции Спирмена, меру связи — по критерию φ. Показатель отношения шансов (ОШ) рассчитывали по стандартной формуле OШ=a/b∙d/c, где a и b — число больных, имеющих и не имеющих полиморфный аллель соответственно; c и d — число пациентов контрольной группы, имеющих и не имеющих полиморфный аллель соответственно. OШ рассчитывали с 95% доверительным интервалом (ДИ). Для оценки влияния нескольких независимых переменных на дихотомическую переменную отклика применяли метод бинарной логистической регрессии. Построение прогностической модели осуществлялось с применением методологии теории распознавания образов. В частности, коэффициенты регрессии в модели определялись с использованием информации только о 75% пациентов, отобранных случайным образом из всех включенных и составивших так называемую «обучающую выборку». Эффективность прогностической модели оценивалась как на «обучающей выборке», так и на «независимой выборке», в которую были включены оставшиеся 25% пациентов. Кроме того, для оценки использовалась ROC-кривая и площадь под нею.

Результаты и обсуждение

Изучаемые группы были сопоставимы по возрасту, месту рождения, национальности и территории постоянного проживания последние 20 лет. Основные демографические, антропометрические и клинические характеристики пациентов представлены в табл. 1. Группа пациентов, перенесших инсульт, отличалась от группы контроля большей долей мужчин, количеством случаев СД2 и статусом курения. Большинство участников обеих групп имели АГ и отягощенную наследственность по развитию ИИ среди родственников первой линии родства. Сопутствующая патология в основной группе была представлена следующими заболеваниями: АГ — у 127 (65%) пациентов, СД2 — у 136 (69%), ожирение — у 145 (73%), висцеральное ожирение — у 188 (96%), парезы после перенесенного инсульта и частичная обездвиженность — у 118 (60%), первичный гипотиреоз — у 38 (19%), хронический бронхит — у 58 (29%), язвенная болезнь желудка или 12-перстной кишки — у 28 (14%), постинсультная депрессия — у 35 (18%), афазия или дизартрия — у 196 (100%) пациентов, симптоматическая эпилепсия — у 27 (13%) пациентов. В группе контроля: АГ — у 73 (66%) пациентов, СД2 — у 13 (11%), ожирение — у 48 (40%), висцеральное ожирение — у 88 (74%), первичный гипотиреоз — у 11 (9%), хронический бронхит — у 17 (14%), язвенная болезнь желудка или двенадцатиперстной кишки — у 8 (7%) пациентов. Информация о лекарственной терапии, получаемой в обеих группах, представлена в табл. 2.

Таблица 2. Лекарственные препараты, получаемые в обеих группах

Данные, полученные при исследовании биохимических и метаболических параметров, представлены в табл. 3.

Таблица 3. Биохимические и метаболические параметры пациентов обеих групп Примечание. Здесь и в табл. 4: данные представлены в виде Me [Q25; Q75], где Ме — медиана, Q25 и Q75 — 0,25 и 0,75 квартили соответственно, или в виде M±SD.

Отмечается более низкий уровень ОХС, ЛПНП в группе пациентов, перенесших первый ИИ, очевидно, связанный с применением гиполипидемических препаратов из группы статинов большинством пациентов, в отличие от группы контроля (см. табл. 2).

Результаты концентрации маркеров сосудистого воспаления и эндотелиальной дисфункции, показаны в табл. 4.

Таблица 4. Маркеры сосудистого воспаления и эндотелиальной дисфункции у пациентов обеих групп (пг/мл)

Отмечаются достоверное снижение уровня провоспалительного IL-1β и увеличение нейропротективного IL-4 в группе пациентов, перенесших первый И.И. Согласно современным данным, провоспалительный цитокин IL-1β играет ключевую роль в развитии воспалительного повреждения нейронов при ИИ [7]. Известно также, что IL-4 представляет собой многофункциональный цитокин, секретируемый в основном Т-хелперами, тучными клетками, эозинофилами, базофилами и стромальными клетками. Накопленные данные свидетельствуют о том, что IL-4 играет особую роль в функции головного мозга как в физиологических, так и в патологических условиях. Так, IL-4, продуцируемый Т-клетками, имеет важное значение для обучения и памяти в здоровом головном мозге. В условиях ишемии IL-4 может способствовать восстановлению головного мозга путем регулирования функций микроглии и макрофагов [8]. Недавние результаты клинических исследований и исследований на животных подтверждают важность IL-4 в острой стадии инсульта. Было показано, что уровень IL-4 в сыворотке крови значительно увеличивается через несколько часов после начала инсульта, но дефицит IL-4 усугубляет нарушения и ухудшает неврологические исходы. Предполагают, что IL-4 служит в качестве эндогенного регулятора нейропротективного механизма, который запускается вскоре после начала инсульта. Показано, что иммуномодуляция IL-4 играет ключевую роль в восстановлении после инсульта, хотя долговременный эффект IL-4 еще до конца не изучен [8]. Таким образом, можно предположить, что компенсаторное повышение уровня нейропотективного IL-4 дает возможность уменьшить воздействие ключевого воспалительного медиатора повреждения нейронов при ИИ — IL-1β.

В табл. 5 представлено

Таблица 5. Таблица сопряженности для определения взаимосвязи между наличием минорного аллеля и наличием первого ИИ Примечание. ¹— критерий χ²; ² — точный критерий Фишера (двусторонний).

сравнение распределения между генотипами, в которых присутствует хотя бы один минорный аллель и в которых нет ни одного минорного аллеля для генов APOB (rs676210), APOB (rs1042031), APOC-IV (rs1132899), ADIPOQ (rs17366743), ADIROR (rs12342), GRM3 (Rs2228595), BDNF (rs6265). Таким образом, не было найдено значимой связи между наличием хотя бы одного минорного аллеля в гене и развитием первого ИИ, на этот результат также указывает и ОШ, рассчитанное для данных групп.

Было показано, что существует связь как между гендерным признаком и развитием первого ИИ, так и между наличием СД2 и первым ИИ (табл. 6).

Таблица 6. Таблица сопряженности для определения взаимосвязи между наличием первого ИИ, полом и СД2

Риск возникновения первого инсульта у женщин в 2,5 раза ниже, чем у мужчин, а у больных СД2 в 18 раз выше, чем у лиц без него.

В результате проведения корреляционного анализа были получены коэффициенты корреляции между наличием ИИ и исследуемыми количественными параметрами (табл. 7).

Таблица 7. Корреляционный анализ антропометрических, метаболических, биохимических параметров, маркеров сосудистого воспаления и эндотелиальной дисфункции с возникновением первого ИИ Примечание. ТБКК — точечно-бисериальный коэффициент корреляции.

Статистически значимо коррелировали: масса тела, индекс массы тела, окружность талии, гомоцистеин, инсулин, адипонектин, цистатин С, Аро А1, Аро В, ОХС, ЛПВП, ЛПНП, триглицериды, СРБ-всч, глюкоза, мочевая кислота, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, ФНО-α, VEGF-A. Мера связи номинальных параметров (наличие отрицательного аллеля в генотипе, гендерный признак и наличие СД2) представлены в табл. 4 и 5 соответственно. Коэффициент меры связи φ между возникновением первого ИИ и наличием генотипов, содержащих хотя бы один минорный аллель, статистически не значим. Коэффициент меры связи φ между наличием СД2 и ИИ имеет значение 0,568 (р<0,0001), а для гендерного признака и ИИ φ= −0,235 (р<0,0001).

Для исключения взаимного влияния входных параметров на математическую модель возникновения первого ИИ была проведена попарная корреляция предикторов. Результаты построения прогностической модели возникновения первого ИИ методом бинарной логистической регрессиив зависимости от входных переменных представлены в табл. 8.

Таблица 8. Параметры модели логистической регрессии

Вероятность возникновения первого ИИ у конкретного пациента рассчитывается по формуле:

P= ________ ,

1+b^â€“z

где z=b₁∙X₁+ b₂∙X₂+…+b_n∙X_n+α; X — значения независимых переменных, b — коэффициенты, которые находят методом бинарной логистической регрессии, α — константа. Если p≤0,5, то можно предположить, что у данного пациента разовьется инсульт, в противном случае инсульт пациенту не угрожает. Как сказано выше, для построения модели использовалась «обучающая выборка», представляющая собой случайным образом отобранную группу размером 75% от общего числа включенных в исследование.

В окончательную модель вошли следующие независимые переменные: масса тела, СД2, Аро А1, IL-1β, IL-4, ADIPOQ (rs17366743), GRM3 (rs2228595). Значение R² Нэйджелкерка составило 0,839. Следует отметить, что наибольший вклад в вероятность развития первого ИИ вносят: СД2, адипонектин, Аро А1, IL-4 (см. табл. 7).

Абсолютные показатели различения моделью «обучающей выборки», представлены в табл. 9.

Таблица 9. Абсолютные показатели качества различения наличия инсульта у пациентов

Согласие модели с «обучающей выборкой» составило 90,7%, с «независимой выборкой» — 87,1%. Общий процент согласия модели по всем пациентам составил 89,8.

В соответствии с полученными данными была построена ROC-кривая (Receiver Operating Characteristic) (см. рисунок).

Определение вероятности развития первого ИИ. По оси абсцисс — специфичность; по оси ординат — чувствительность.

Площадь под ROC-кривой составила 0,92, что соответствует, согласно экспертной шкале, высокой прогностической значимости построенной модели. Исходя из требования баланса между чувствительностью и специфичностью, значения которых должны быть максимальными, был определен оптимальный порог отсечения (optimal cut-off value), который составил 0,5.

В результате проведенного корреляционного и регрессионного анализов был выделен ряд параметров, обладающих наибольшей прогностической значимостью в отношении развития первого ИИ. В частности, уровни адипонектина, Аро А1 и IL-4 обладали большей корреляционной связью с развитием первого ИИ и вошли в прогностическую модель. Высокая мера связи была определена между наличием СД2 и развитием первого ИИ, который также вошел в окончательную прогностическую модель. Из всех изучаемых в исследовании параметров, наибольший вклад в вероятность развития первого ИИ, согласно полученной модели (см. табл. 8), вносят СД2, адипонектин, Аро А1, IL-4. Настоящие результаты согласуются с результатами недавно опубликованных исследований и проведенных метаанализов, что может свидетельствовать о значимом вкладе в патогенез ИИ изменений в уровнях адипонектина и Аро А1, а также активации сосудистого воспаления и потенцирующем влиянии цитокинов на процесс атеротромбоза [7—11]. Попытки создать оптимальную модель, предсказывающую развитие первого ИИ, многократно предпринимались в разных странах на протяжении последних десятилетий [8—14]. Отмечается тенденция к совпадению включаемых в модель входящих факторов, таких как СД2, возраст, пол, статус курения, АГ, уровень ОХС в различных сочетаниях. Однако в большинстве случаев результатом становилась модель с площадью под ROC-кривой от 0,62 до 0,67, что соответствует, согласно экспертной шкале, средней прогностической значимости построенной модели. Таким образом, включение в прогностическую модель, помимо традиционных факторов риска, новых маркеров может улучшить стратификацию риска, что и было показано в настоящем исследовании.

Заключение

Проведение исследований по изучению взаимосвязи клинических, биохимических, метаболических, сосудистых предикторов и полиморфизмов разных генов, которые могут быть вовлечены в патогенез инсульта, позволяет, с одной стороны, лучше понять причины и механизмы развития данного заболевания, а с другой — разработать скрининговые тесты для определения риска развития первого ИИ и соответствующие программы профилактики.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: veronika-1306@mail.ru