Окислительный стресс при фокальной симптоматической и криптогенной эпилепсии в молодом возрасте

Читать метаданные

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение окислительного стресса у пациентов молодого возраста с фокальной симптоматической и криптогенной эпилепсией и после впервые развившихся эпилептических приступов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Участвовавшие в исследовании 90 пациентов в возрасте от 19 до 44 лет были распределены в три группы по 30 больных пациенты после единичных эпилептических приступов, с клинической ремиссией приступов в течение 1 года и более и эпилептических приступов, резистентных к лечению. Наряду с этим в работу были включены практически здоровые лица (20 человек), которые составляли контрольную группу. Исследованы показатели прооксидантного статуса — ТБК-активные продукты, а также антиоксидантной защиты — общая супероксид-перехватывающая активность плазмы, активность каталаза, общая антиоксидантная активность плазмы крови и восстановленные тиолы (SH-группы) плазмы крови.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Выявлено отсутствие достоверных различий по концентрации ТБК-активных продуктов в плазме крови пациентов с эпилепсией и контрольной группы. По остальным исследуемым параметрам (концентрации восстановленных SH-групп, общая супероксид-перехватывающая активность плазмы, активность каталазы) и для общей антиоксидантной активности плазмы выявлено их достоверное снижение по сравнению с контролем. По ряду исследуемых показателей выявлены достоверные межгрупповые отличия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изменения свобoднорадикальных процессов по сравнению с нормой выявлены уже после первых приступов и сохраняются при резистентой эпилепсии и клинической ремиссии. Учитывая, что в разных группах больных эпилепсией показатели активности антиоксидантной защиты достоверно отличаются между собой, можно предположить, что после первых эпилептических приступов, а также при различном течении болезни реализуются разные звенья окислительного стресса.

Ключевые слова:

окислительный стресс

антиоксидантная защита

эпилепсия

Авторы:

Федин А.И.

ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

РИНЦ AuthorID: 167799
Scopus AuthorID: 7007163263
ORCID: 0000-0002-6996-2828

Старых Е.В.

Баранова О.А.

Чеканов А.В.

Торшин Д.В.

ГБУЗ «Городская клиническая больница №13 Департамента здравоохранения Москвы»;
ФГБУЗ «Центральная клиническая больница РАН»

Михайлова Е.В.

Дата поступления:

12.02.2020

Дата принятия в печать:

14.02.2020

Список литературы:

Крыжановский Г.Н. Сравнительный анализ содержания продуктов перикисного окисления липидов в коре головного мозга, спинномозговой жидкости и периферической крови при эпилептической активности. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1983;11:36-38. https://doi.org/10.1007/BF00835279
Федин А.И. Оксидативный стресс и применение антиоксидантов в неврологии. Нервные болезни. 2002;1:15-18.
Саватеев А.В., Назаров П.Г., Любимов Ю.А. Окислительные и митохондриальные механизмы в иммунопатогенезе эпилепсии. Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2003;2(1):46-65.
Липатова Л.В., Дубинина Е.Е., Алексеева Д.В., Капустина Т.В., Лысенко И.С. Исследование состояния про- и антиоксидантной системы у больных эпилепсией и оценка возможностей болезньмодифицирующей терапии. Сибирское медицинское обозрение. 2017;1:38-43. https://doi.org/10.20333/2500136-2017-1-38-43
Крыжановский Г.Н., Никушкин Е.В., Тупеев И.Р., Браславский В.Е. Противосудорожное действие супероксиддисмутазы. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1987;103(4):396-398. https://doi.org/10.1007/BF00842461
Kong Q, Lin CLG. Oxidative damage to RNA: mechanisms, consequences, and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 2010;67(11):1817-1829. https://doi.org/10.1007/s00018-010-0277-y
Rong Y, Doctrow SR, Tocco G, Baudry M. EUK-134, a synthetic superoxide dismutase and catalase mimetic, prevents oxidative stress and attenuates kainate-induced neuropathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1999;96(17):9897-9902. https://doi.org/10.1073/pnas.96.17.9897
Авакян Г.Г., Неробкова Л.Н., Олейникова О.М., Воронина Т.А., Авакян Г.Н., Гусев Е.И. Возможности применения вальпроатов и антиоксиданта при вторично-генерализованных приступах (клинико-экспериментальное исследование). Эпилепсия и пароксизмальные состояния. 2011;3(2):34-44.
Коротков А.Г., Музалевская Д.С., Колоколов О.В. Роль антиоксидантов в комплексном лечении эпилепсии. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2016;116(9-2):44-48. https://doi.org/10.17116/jnevro20161169244-48
Mihara M, Uchiyama M. Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Anal Biochem. 1978;86:271-278.
Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys. 1959;82(1):70-77.
Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток. М.: Медицинская пресса; 2006.
Ernst A, Stolzing A, Sandig G, Grune T. Protein oxidation and the degratation of oxidized protejn in the rat oligodendrocyte cell line OLN93-antioxidative effect of the intracellular spin trapping agent PBN. Brain Res Mol Brain. 2004;122:126-132. https://doi.org/10.1016/j.molbrainres.2003.12.005
Popov I, Lewin G. Photochemiluminescent detection of antiradical activity. VII. Comparison with a modified method of thermo-initiated free radical generation with chemiluminescent detection. Luminescence. 2005;20(4-5):321-325. https://doi.org/10.1002/bio.856
Созарукова М.М., Полимова А.М., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А. Изменения в кинетике хемилюминесценции плазмы как мера системного окислительного стресса в организме человека. Биофизика. 2016;61(2):337-344. https://doi.org/10.1134/S0006350916020202
Tsai K, Hsu TG, Kong CW, Lin KC, Lu FJ. Is the endogenous peroxyl-radical scavenging capacity of plasma protective in systemic inflammatory disorders in humans? Free Radical Biology and Medicine. 2000;28(6):926-933. https://doi.org/10.1016/S0891-5849(00)00180-5
Полунина О.С., Севостьянова И.В., Воронина Л.П. Активность супероксиддисмутазы при фибрилляции предсердий. Современные проблемы науки и образования. 2016;4:6:107-114.
Lopez J, González ME, Lorigados L, Morales L, Riveron G, Bauza JY. Oxidative stress markers in surgically treated patients with refractory epilepsy. Clinical Biochemistry. 2007;40(5-6):292-298. https://doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2006.11.019
Ben-Menachem E, Kyllerman M, Marklund S. Superoxide Dismutase and Glutathione Peroxidase Function in Progressive Myoclonus Epilepsies. Epilepsy Research. 2000;40:33-39. https://doi.org/10.1016/S0920-1211(00)00096-6
Bellissimo MI, Amado D, Abdalla DSP, Ferreira EC, Cavalheiro EA, Naffah-Mazzacoratti MG. Superoxide dismutase, glutathione peroxidase activities and the hydroperoxide concentration are modified in the hippocampus of epileptic rats. Epilepsy Research. 2001;46(2):121-128. https://doi.org/10.1016/S0920-1211(01)00269-8
Menon B, Ramalingam K, Kumar RV. Low plasma antioxidant status in patients with epilepsy and the role of antiepileptic drugs on oxidative stress. Annals of Indian Academy of Neurology. 2014;17(4):398. https://doi.org/10.4103/0972-2327.144008
Płonka-Półtorak E, Westermarck T, Kaipainen P, Kaski M, Atroshi F. Trace Elements, Antioxidant Enzymes and Free Carnitine Levels Among Epileptic Patients Treated with Valproate Monotherapy. Pharmacology, Toxicology and Pharmaceutical Science. 2014;11:265-277. https://doi.org/10.5772/57613
Hamed SA, Abdellah MM, El-Melegy N. Blood Levels of Trace Elements, Electrolytes, and Oxidative Stress/Antioxidant Systems in Epileptic Patients. Journal of Pharmacological Sciences. 2004;96(4):465-473. https://doi.org/10.1254/jphs.FPJ04032X
Thanoon IA, Pachachi OA, Al-Sheikh MM. Effects of carbamazepine on serum leptin, insulin levels and oxidative stress in epileptic patients. Annals of the College of Medicine. 2012;38(1):40-45. https://doi.org/10.33899/mmed.2012.50066
Tüfekçi A, Koyuncuoğlu HR, Kirbaş S, Yilmaz HR, Kirbaş A. The Effects of Pregabalin on Cerebral Cortical Oxidative Stress of Rats on Pentylenetetrazole Induced Epileptic Seizure. Epilepsi. 2013;19(1):7-14. https://doi.org/10.5505/epilepsi.2013.85057

Закрыть метаданные

В настоящее время многими учеными эпилепсия рассматривается как свободнорадикальная патология [1—4] с истощением ферментативных компонентов антиоксидантной защиты и активацией прооксидантных систем . В основу данного утверждения легли результаты экспериментальных исследований Г.Н. Крыжановского 1983 г. Активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) может являться следствием эпилептического приступа и звеном механизма его генерации. Поэтому во время судорожного приступа резко возрастает количество продуктов ПОЛ, в то время как суммарная антиоксидантная активность ткани мозга снижается [5]. В экспериментальных работах показано, что вызванные судороги могут быть частично предотвращены с помощью антиоксидантов, таких как супероксиддисмутаза-миметиков, мелатонина и витамина C [6]. Каталитические антиоксиданты могут уменьшать окислительные повреждения у животных с эпилепсией, хотя не снижают продолжительность приступов или длительность межприступных периодов [7]. При лечении эпилепсии применяется антиоксидантная терапия, в том числе ферментативная в качестве аугментирующей [3, 8, 9].

Цель исследования — изучение окислительного стресса у пациентов молодого возраста с фокальной симптоматической и криптогенной эпилепсией.

Материал и методы

Все пациенты в возрасте от 19 до 44 лет были распределены в 3 группы по 30 больных. После единичных (первых) эпилептических приступов (1-я группа), с клинической ремиссией в течение 1 года и более (2 я группа) и вторично-генерализованных эпилептических приступов, резистентных к лечению, с частотой вторично-генерализованных приступов от 4 в 1 год до 1—2 в 1 нед, парциальных — от 2 в 1 нед до 5 в 1 день (3-я группа). Общее количество эпилептических приступов в 1-й группе пациентов с дебютом заболевания не превышало 5, причем сюда входили приступы, наблюдавшиеся по 2—3 раза в течение 1 дня. Давность развития приступов на момент включения в исследование составляла не более 0,5 года.

Средняя длительность заболевания в группе пациентов с эпилептическими приступами, резистентными к лечению, составляла 19 лет, у пациентов с ремиссией — 12 лет. Пациенты 1-й группы противоэпилептическую терапию не получали, пациенты 2-й и 3-й групп получали противоэпилептические препараты (ПЭП) в виде моно- и политерапии. Наряду с этим в работу были включены практически здоровые лица (20 человек), которые составляли контрольную группу.

Биохимический анализ крови (общий белок, альбумин, мочевая кислота) проводили на биохимическом анализаторе Sapphire-400 (Япония).

Исследованы показатели прооксидантного статуса — ТБК-активные продукты, а также антиоксидантной защиты — общая супероксид-перехватывающая активность плазмы, каталаза, общая антиоксидантная активность плазмы крови и восстановленные тиолы (SH-группы) плазмы крови. Определение ТБК-активных продуктов осуществляли спектрофотометрическим методом [10]; концентрацию SH-групп определяли спектрофотометрическим методом при измерении оптической плотности при длине волны 412 нм [11]; общую супероксид-перехватывающую активность плазмы и активность каталазы определяли при помощи колориметрического метода с использованием набора реагентов Superoxide Dismutase Assay Kit («Cayman Chemical», США), каталожный номер 706002, и Catalase Assay Kit («Cayman Chemical», США), каталожный номер 707002. Регистрацию общей антиоксидантной активности плазмы крови проводили на хемилюминометре LUM-1200 (Россия), в качестве активатора использовали люминол.

Стандартный образец содержал 10 мМ боратного буфера (рН 9,0), 10 мкМ люминола, 100 мкл плазмы, разбавленной в 100 раз, 10 мкМ водорастворимого азоинициатора ААРН. Общий объем пробы составлял 1000 мкл. Реакцию запускали добавлением 10 мкМ ААРН. Измеряли интеграл под кривой спектра хемилюминесценции (ХЛ) — светосумму — в интервале времени с 0-й по 12-ю минуту. Далее рассчитывали светосумму свечения (ΔS) — разность светосуммы контрольного (без плазмы) и опытного (с плазмой) образцов в период измерения с 0-й по 12-ю минуту.

Длительность измерения составляла 16 мин.

Клиническое исследование проводили в соответствии с принципами Хельсинкской декларации последнего пересмотра (2000 г.) и требованиями качественной клинической практики.

Полученные результаты обрабатывали с помощью программ Excel и Statistica, версия 6. Для анализа различий количественных признаков в трех несвязанных группах и более использовали статистический критерий Краскела—Уоллиса ANOVA, в двух несвязанных группах применяли критерий Манна—Уитни. Достоверными считали различия при p<0,05.

Результаты и обсуждение

При исследовании было выявлено отсутствие достоверных различий концентрации ТБК-активных продуктов в плазме крови у пациентов с эпилепсией и контрольной группы. По остальным исследуемым параметрам (концентрации восстановленных SH-групп, общая супероксид-перехватывающая активность плазмы, активность каталазы, общая антиоксидантная активность плазмы) выявлено их достоверное снижение по сравнению с контролем.

Достоверное снижение концентрации восстановленных SH-групп во всех трех группах пациентов с эпилепсией по сравнению с пациентами контрольной группы свидетельствует об окислительном повреждении тиолсодержащих низкомолекулярных соединений плазмы крови. Считается, что в состоянии окислительного стресса атаке активными формами кислорода в первую очередь подвергаются не липиды, а белки плазматических мембран [12, 13]. Концентрация восстановленных SH-групп в плазме крови у пациентов 1-й группы составляла Me 0,29 мМ [LQ=0,26; UQ=0,31]; 2-й — Me 0,24 мМ [LQ=0,22; UQ=0,29]; 3-й — Me 0,27 мМ [LQ=0,24; UQ=0,29]; контрольной — Me 0,41 мМ [LQ=0,37; UQ=0,51] (рис. 1). Кроме того, выявлено достоверное повышение концентрации восстановленных SH-групп у пациентов 1-й группы по сравнению со 2-й группой (p=0,043) и 3-й (p=0,049). Данный факт может быть связан с длительностью течения заболевания: чем больше времени прошло с момента начала заболевания, тем выше уровень окислительного повреждения низкомолекулярных тиолов.

Рис. 1. Концентрация восстановленных SH-групп в плазме крови.

* — p<0,05 по сравнению с контрольной группой; ** — p<0,05 по сравнению с 3-й группой; *** — p<0,05 по сравнению со 2-й группой. Здесь и на рис. 3 и 4: 1 — 1-я группа; 2 — 2-я группа; 3 — 3-я группа; 4 — контрольная группа.

При исследовании общей антиоксидантной активности плазмы крови за количественный критерий степени тушения ХЛ была принята ΔS. Величина ΔS прямо пропорциональна объему добавленной в образец плазмы крови в исследуемом нами диапазоне объемов (рис. 2), а значит линейно зависит и от количества содержащихся в плазме антиоксидантных соединений. Данный факт позволяет использовать ΔS как критерий оценки уровня содержания плазменных антиоксидантов [14].

Рис. 2. Зависимость ΔS от объема плазмы крови в образце.

Общая антиоксидантная активность плазмы крови, о которой судили по ХЛ (рис. 3), также была достоверно ниже у всех трех групп пациентов с эпилепсией по сравнению с контролем (p=0,008). Этот факт позволяет сделать вывод о том, что общая антиоксидантная активность плазмы крови у пациентов с эпилепсией снижается вне зависимости от длительности, стадии и тяжести заболевания.

Рис. 3. Величина ΔS.

* — p<0,05 по сравнению с контрольной группой; ** — p<0,05 по сравнению со 2-й группой; *** — p<0,05 по сравнению с 3-й группой.

Величина площади подавления ХЛ составляла МЕ=3710 отн. ед. [LQ=2320; UQ=4695]; Ме=8315 отн. ед. [LQ=6143; UQ=12300]; Ме=7415 отн. ед. [LQ=5437; UQ=10 239] в 1, 2 и 3-й группах больных с эпилепсией и Ме=14 371 отн. ед. [LQ=12 706; UQ=16 865] в контрольной группе. При попарном сравнении групп пациентов с эпилепсией были выявлены достоверно более низкие значения ∆S в 1-й группе по сравнению со 2-й (p=0,0001) и 3-й (p=0,009). Исходя из данных результатов, можно сделать заключение, что пациенты в стадии манифестации заболевания имеют более низкий уровень общей антиоксидантной активности плазмы крови по сравнению с пациентами с более продолжительным течением эпилепсии. Вероятно, это связано со следующими факторами:

1. Пациенты с впервые возникшими приступами не находились на какой-либо лекарственной терапии, которая, возможно, способствует повышению антиоксидантной устойчивости организма. Это согласуется с установленными нами более высокими уровнями антиоксидантной устойчивости плазмы крови у пациентов в ремиссии и пациентов с резистентной формой заболевания, которые принимали ПЭП.

2. У пациентов на стадии манифестации эпилепсии наблюдается дисбаланс активации окислительных и антиоксидантных физиологических процессов: антиокислительные системы не успевают должным образом активироваться в ответ на интенсивные свободнорадикальные процессы, инициируемые эпилептическими приступами.

Из данных литературы [15] известно, что общая антиоксидантная активность плазмы крови в основном определяется содержанием в ней таких веществ, как мочевая кислота, мочевина и альбумин. Помимо этого, в меньшей мере данное свойство плазмы крови зависит от концентрации в плазме альфа-токоферола, аскорбата, восстановленного глутатиона, билирубина и коэнзима Q [16].

Нами были изучены плазменные концентрации мочевой кислоты, альбумина, билирубина и мочевины, которые у обследованных пациентов оказались в пределах нормы.

Учитывая данный факт, а также снижение концентрации восстановленных сульфгидрильных групп в плазме крови всех трех групп пациентов, можно сделать предположение, что именно снижение содержания восстановленных тиолсодержащих низкомолекулярных антиоксидантов (глутатион, цистеин и т.д.), вызванное интенсивно протекающими окислительными процессами, оказывает существенное влияние на уровень общей антиоксидантной активности плазмы крови. Помимо этого, альбумин, который играет важную роль в системе антиоксидантной защиты плазмы, может находиться в крови как в восстановленном, так и окисленном состоянии. Только восстановленная форма альбумина способна оказывать антиоксидантный эффект. Биохимический анализ крови, на который мы опирались при анализе результатов, дает информацию о суммарной фракции альбумина без учета степени его окисленности. Вероятно, у пациентов с эпилепсией повышена доля окисленного альбумина, что сказывается на уровне общей антиоксидантной активности плазмы крови. Данные предположения требуют более детального исследования.

Для выявления антиоксидантного статуса организма также определяли общую супероксид-перехватывающую активность плазмы крови. Как известно, при участии супероксиддисмутазы прерывается цепь свободнорадикальных процессов на стадии одноэлектронного восстановления кислорода с образованием супероксидного анион-радикала.

Проведено сравнение уровней общей супероксид-перехватывающей активности в сыворотке крови больных эпилепсией и условно здоровых людей, приведенных в соответствии с источниками литературы [17]. Общая супероксид-перехватывающая активность плазмы крови пациентов с эпилепсией составляла МЕ=0,021 ед.акт./мл [LQ=0,012; UQ=0,025]; Ме=0,013 ед. акт./мл [LQ=0,008; UQ=0,018]; Ме=0,024 ед. акт./мл [LQ=0,019; UQ=0,025] в 1, 2 и 3-й группах соответственно и Ме=0,100 ед. акт./мл [LQ=0,047; UQ=0,257] в группе здоровых. Было выявлено существенное снижение общей супероксид-перехватывающей активности в плазме крови у пациентов всех трех групп по сравнению с показателями нормы, что согласуется с данными исследований других авторов [18—20].

Кроме того, общая супероксид-перехватывающая активность у пациентов, находящихся в медикаментозной ремиссии, оказалась достоверно ниже данного показателя у пациентов с впервые возникшими приступами (p=0,041) и резистентной к лечению формой заболевания (p=0,003) (рис. 4).

Рис. 4. Общая супероксид-перехватывающая активность плазмы крови у пациентов с эпилепсией (ед. акт./мл), 1, 2, 3-я группы.

* — p<0,05 по сравнению с нормой; ** — p<0,05 по сравнению с 3-й группой; *** — p<0,05 по сравнению с 1-й группой.

При измерении активности каталазы, как и в случае с общей супероксид-перехватывающей активностью, установлено снижение данного показателя в плазме крови у пациентов с эпилепсией в сравнении с таковым у здоровых (p<0,05). Достоверные различия при сравнении активности каталазы у пациентов трех обследуемых групп в данном случае не найдены.

Результаты данной работы согласуются с результатами подобного исследования, в котором не было выявлено какой-либо разницы в уровне активности каталазы плазмы крови у леченых и нелеченых ПЭП пациентов [21].

Заключение

Полученные результаты могут объясняться, с одной стороны, первичными изменениями свободнорадикальных процессов, а с другой — приемом лекарственной терапии, влияющей на антиоксидантную устойчивость организма в целом, в группах больных с клинической ремиссией и пациентов с резистентной формой заболевания [21—25].

Тем не менее с учетом всего вышеизложенного можно сделать заключение, что изменения свободнорадикальных процессов по сравнению с нормой выявлены уже после первых приступов, сохраняются при резистентной эпилепсии и клинической ремиссии. Учитывая, что в разных группах пациентов с эпилепсией показатели активности антиоксидантной защиты достоверно отличаются между собой, можно предположить, что после первых эпилептических приступов, а также при различном течении болезни реализуются разные звенья окислительного стресса.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.