Ишемический инсульт является одной из главных проблем современной неврологии и одной из ведущих причин смерти и инвалидности населения. По данным Всемирной организации здравоохранения, инсульт ежегодно поражает примерно 15 млн человек, что приводит к 5 млн смертей в острой фазе заболевания и более чем 5 млн случаев инвалидности [1]. Кроме того, инсульт представляет значительное экономическое бремя для систем здравоохранения и общества в целом, при этом прямые и косвенные затраты на лечение и реабилитацию после инсульта, по различным оценкам, составляют от 28 до 68 млрд долларов в год только в США [2]. В Российской Федерации статистика заболеваемости и летальности также остается неутешительной: 21% летальных случаев от неинфекционных причин приходится на долю ишемического инсульта. Приблизительно 30% пациентов, перенесшим инсульт, требуется помощь в выполнении повседневных задач, 20% — теряют способность к самостоятельному передвижению [3].
Высокая значимость инсульта во многом связана с его мультифакторным этиопатогенезом, в котором объединяются несколько механизмов, приводящих к деструкции мозговой ткани. Первичное повреждение клеток головного мозга возникает вследствие прекращения тока крови, но большее значение приобретает вторичное повреждение, связанное с развитием глутаматно-кальциевой эксайтотоксичности, нейровоспаления, окислительного стресса и нарушением метаболизма [4]. Современные исследования показывают, что одним из значимых механизмов развития ишемического инсульта являются нарушения функционирования митохондрий клетки — митохондриальная дисфункция. Как указывают S. Andrabi и соавт. [5], поврежденные митохондрии при инсульте являются основными источниками активных форм кислорода (АФК), инициируют апоптоз и реакции нейровоспаления, а также способствуют дефициту энергии с преобладанием анаэробного метаболизма и развитием лактоацидоза. Таким образом, можно предположить, что митохондрии клетки в условиях острого нарушения мозгового кровообращения занимают одну из ведущих позиций в реакциях ишемического каскада и могут являться перспективной фармакотерапевтической мишенью для средств нейропротективного действия [6]. В настоящее время для адъювантной терапии ишемического инсульта успешно применяются соли этилметилгидроксипиридина, в частности сукцинат (ЭМГПС) [7] и малат (ЭМГПМ) [8]. Также следует отметить, что ЭМГПС оказывает положительное влияние на изменение митохондриальной функции при ишемическом инсульте в эксперименте. В ранее проведенных исследованиях было показано, что пероральное введение ЭМГПС в условиях фокальной ишемии головного мозга способствует повышению активности комплексов митохондриальной дыхательной цепи и стабилизирует аэробный метаболизм [9]. Кроме того, Ю.И. Кировой и соавт. [10] было продемонстрировано, что янтарная соль этилметилгидроксипиридина улучшает митохондриогенез при курсовом введении как у молодых, так и у старых животных. Однако в литературе практически отсутствуют сведения, касающиеся изменения структурно-функциональных свойств митохондрий клетки под действием ЭМГПМ. Таким образом, актуально сравнительное изучение влияния ЭМГПС и ЭМГПМ на развитие митохондриальной дисфункции в условиях ишемического инсульта.
Цель исследования — оценить влияние ЭМГПС и ЭМГПМ на изменение митохондриальной функции у животных с фокальной ишемией головного мозга.
Материал и методы
Исследование выполнено на 80 крысах-самцах линии Wistar. Животные были получены из питомника лабораторных животных «Рапполово» и на время исследования содержались в помещениях вивария в контролируемых условиях: температура окружающего воздуха 22±2 °C, относительная влажность 60±5%, при естественной смене суточного цикла и со свободным доступом к полнорационному корму и воде. Фокальную ишемию головного мозга воспроизводили по методу A. Tamura и соавт. [11] у наркотизированных хлоралгидратом (350 мг/кг, внутрибрюшинно) крыс путем необратимой правосторонней термокоагуляции средней мозговой артерии. В процессе выполнения исследования были сформированы следующие экспериментальные группы: ЛО — ложнооперированные животные (к данной группе животных применялись все последовательные операционные процедуры, за исключением коагуляции артерии); НК — негативный контроль (крысы с ишемией головного мозга, но не получавшие терапию); группы животных с ишемией головного мозга, получавшие ЭМГПС (Мексидол, «ФАРМАСОФТ», Россия) в дозе 50, 100 и 150 мг/кг; группы животных с церебральной ишемией, которым вводили ЭМГПМ (Этоксидол, ОАО «Синтез», Россия) в аналогичных дозировках. Препараты вводили внутривенно (в хвостовую вену, при этом крыс фиксировали в рестейнере) через 30 мин после моделирования ишемии и далее однократно в сутки на протяжении 3 дней. По истечении указанного времени у животных оценивали изменение неврологического дефицита по шкале McGraw [12], где выраженность неврологических изменений определяли по сумме соответствующих баллов. Сумма баллов 0,5—2,0 соответствовала легкой степени неврологического дефицита; 2,5—5,0 — средней степени; 5,5—10 тяжелой степени.
После оценки неврологических изменений крыс декапитировали под анестезией и извлекали головной мозг, отделяя правое полушарие, которое гомогенизировали в буферном растворе, состоящем из: 1 ммоль ЭГТА + 215 ммоль маннита + 75 ммоль сахарозы + 0,1% раствор бычьего сывороточного альбумина + 20 ммоль HEPES, с pH 7,2. Полученный гомогенат центрифугировали при 1100 g в течение 2 мин. Полученный супернатант разделяли на две части. Первую аликвоту в количестве 700 мкл переносили в пробирки Эппендорфа и наслаивали 75 мкл 10 перколла. Полученную смесь центрифугировали при 18 000 g в течение 10 мин. Осадок ресуспендировали в 1 мл изолирующей среды и повторно центрифугировали в течение 5 мин при 10 000 g [13]. Полученный вторичный супернатант использовали для оценки изменения аэробного клеточного дыхания, а также оценки активности цитохром-с-оксидазы, сукцинатдегидрогеназы и содержания митохондриального пероксида водорода. Во второй аликвоте первичного супернатанта оценивали изменение концентрации апоптоз-индуцирующего фактора (АИФ) и интенсивность анаэробных реакций клеточного дыхания.
Активность цитохром-с-оксидазы (Ед/мг белка) определяли по изменению оптической плотности среды реакции окисления цитохрома C (II) в присутствии KCN при 500 нм [14]. Активность сукцинатдегидрогеназы (Ед/мг белка) оценивали спектрофотометрически при 600 нм в ходе реакции сукцинат-зависимого восстановления дихлорфенолиндофенола в присутствии ротенона [15].
Концентрацию митохондриального пероксида водорода определяли с использованием стандартного набора Amplex Red («Thermo Fisher Scientific»). Интенсивность аэробного клеточного дыхания определяли по изменению потребления кислорода в анализируемой среде при добавлении 4-трифлуорометокси-фенил-гидразоно-малононитрила в концентрации 1 µM/л и пирувата (15 ммоль/л) в качестве субстрата. Активность анаэробного обмена оценивали респирометрически при внесении в среду олигомицина (1 µг/мл) и глюкозы (15 ммоль/л) в качестве субстрата. Потребление кислорода регистрировали на лабораторном респирометре АКПМ 1-01Л и выражали в промилле/мг белка, содержание которого определяли по методу Бредфорда [13, 16]. Концентрацию АИФ определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с применением видоспецифичных реактивов («Cloud Clone corp.», США).
Содержание и манипуляции с животными соответствовали положениям Директивы ЕС2010/63 «О защите животных, использующихся в научных целях».
Статистический анализ проводили с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0. («StatSoft», США). Нормальность распределения данных оценивали с применением теста Шапиро—Уилка. Однородность дисперсий определяли тестом Левена. Статистически значимые отличия между группами оценивали методом однофакторного дисперсионного анализа с пост-тестом Ньюмена—Кейлса (при нормальном распределении данных) или тестом Краскелла—Уоллиса (при распределении данных, отличных от нормального) при критическом уровне значимости p<0,05.
Результаты
В ходе исследования было установлено, что у животных группы НК неврологический дефицит (табл. 1) увеличился, в сравнении с ЛО крысами, в 11,0 раз (p<0,05). В то же время применение ЭМГПС в дозах 50, 100 и 150 мг/кг приводило к снижению выраженности неврологических нарушений у животных по отношению к нелеченым крысам на 36,4% (p<0,05); 40,9% (p<0,05) и 45,5% (p<0,05). У животных, которым вводили ЭМГПМ (50—150 мг/кг), также наблюдалось уменьшение неврологического дефицита относительно крыс группы НК на 22,7% (p<0,05); 31,8% (p<0,05) и 40,9% (p<0,05). При этом у животных, получавших ЭМГПС в дозе 50 мг/кг, выраженность неврологических нарушений была достоверно меньше, чем у крыс, которым вводили ЭМГПМ в эквивалентной дозе, на 23,5% (p<0,05). Между остальными изучаемыми показателями статистически достоверных отличий не обнаружено (см. табл. 1).
Таблица 1. Влияние ЭМГПС и ЭМГПМ на изменение неврологического дефицита у животных с фокальной ишемией головного мозга
| Балл неврологического дефицита, усл.ед | |||||||
| ЛО | НК | ЭМГПС 50 мг/кг | ЭМГПС 100 мг/кг | ЭМГПС 150 мг/кг | ЭМГПМ 50 мг/кг | ЭМГПМ 100 мг/кг | ЭМГПМ 150 мг/кг |
| 0,5±0,25 | 5,5±0,13# | 3,5±0,28* | 3,25±0,26* | 3±0,15* | 4,25±0,23* Δ | 3,75±0,17* | 3,25±0,15* |
Примечание. # — достоверно относительно ЛО крыс (тест Ньюмена—Кейлса, p<0,05); * — достоверно относительно НК группы крыс (тест Ньюмена—Кейлса, p<0,05); Δ — достоверно относительно животных, получавших ЭМГПС в дозе 50 мг/кг (тест Ньюмена—Кейлса, p<0,05).
Анализ изменения концентрации митохондриального пероксида водорода (табл. 2) показал, что у крыс группы НК данный показатель превышал аналогичный у ЛО животных в 3,8 раза (p<0,05). Применение ЭМГПС в дозах 50, 100 и 150 мг/кг способствовало уменьшению содержания пероксида водорода на 22,2, 39,2 и 40,2% соответственно (все показатели p<0,05 относительно группы НК), тогда как введение ЭМГПМ в аналогичных дозах приводило к снижению концентрации митохондриального пероксида водорода на 18,4% (p<0,05); 30,4% (p<0,05) и 38,1% (p<0,05) соответственно (см. табл. 2).
Таблица 2. Влияние ЭМГПС и ЭМГПМ на изменение митохондриальной функции у животных с фокальной ишемией головного мозга
| Группа | Аэробное дыхание (ppm/мг белка) | Анаэробное дыхание (ppm/мг белка) | Концентрация митохондриального H2O2 (мкмоль/мл) | Концентрация АИФ (нг/мл) | Активность сукцинат-дегидрогеназы (Ед/мг белка) | Активность цитохром-с-оксидазы (Ед/мг белка) |
| ЛО | 85,2±1,3 | 10,1±1,8 | 0,42±0,09 | 1,7±0,08 | 2,4±0,05 | 4,1±0,03 |
| НК | 35,4±1,4# | 61,9±1,3# | 1,58±0,04# | 9,7±0,03# | 1,36±0,03# | 1,77±0,07# |
| ЭМГПС 50 мг/кг | 45,6±1,5* | 45±0,4* | 1,23±0,05* | 7,4±0,05* | 1,58±0,06* | 2,14±0,03* |
| ЭМГПС 100 мг/кг | 53,9±0,8* | 36,7±1,6* | 0,97±0,06* | 5,9±0,05* | 1,74±0,01* | 2,34±0,03* |
| ЭМГПС 150 мг/кг | 57,5±1* | 33,9±1,7* | 1,19±0,07* | 5,8±0,02* | 2,1±0,07* | 2,75±0,07* |
| ЭМГПМ 50 мг/кг | 37,1±1,4* Δ | 57,8±1* Δ | 1,29±0,02* | 7,6±0,08* | 1,41±0,02* Δ | 1,98±0,01* Δ |
| ЭМГПМ 100 мг/кг | 46,1±0,9* | 39,6±1* | 1,1±0,06* | 6,1±0,08* | 1,57±0,02* | 2,24±0,02* |
| ЭМГПМ 150 мг/кг | 51,8±0,6* | 35,8±1,5* | 1,21±0,07* | 6±0,06* | 1,95±0,09* | 2,64±0,06* |
Примечание. # — достоверно относительно ЛО крыс (тест Ньюмена—Кейлса, p<0,05); * — достоверно относительно НК группы крыс (тест Ньюмена—Кейлса, p<0,05); Δ — достоверно относительно животных, получавших ЭМГПС в дозе 50 мг/кг (тест Ньюмена—Кейлса, p<0,05).
Также в ходе исследования было показано, что у крыс группы НК концентрация АИФ (см. табл. 2) в мозговой ткани превосходила таковую у ЛО животных в 5,7 раза (p<0,05). Введение ЭМГПС и ЭМГПМ способствовало уменьшению содержания АИФ по сравнению с нелечеными животными в дозе 50 мг/кг на 23,7% (p<0,05) и 21,6% (p<0,05), в дозе 100 мг/кг на 39,2% (p<0,05) и 37,1% (p<0,05), в дозе 150 мг/кг на 40,2% (p<0,05) и 38,1% (p<0,05) соответственно.
Анализируя изменение активности сукцинатдегидрогеназы и цитохром-с-оксидазы (см. табл. 2), было установлено снижение активности данных ферментов у крыс группы НК на 43,3% (p<0,05) и 56,8% (p<0,05) соответственно (в сравнении с ЛО животными). Введение ЭМГПС (в дозах 50—150 мг/кг) способствовало повышению активности сукцинатдегидрогеназы, в сравнении с нелечеными животными, на 16,2, 27,9 и 54,4% соответственно (все показатели p<0,05), тогда как применение ЭМГПМ повышало активность фермента только в дозах 100 и 150 мг/кг — на 15,4% (p<0,05) и 43,4% (p<0,05) соответственно. Аналогичная тенденция изменений была отмечена при анализе активности цитохром-с-оксидазы. На фоне введения ЭМГПС в дозах 50, 100 и 150 мг/кг отмечено увеличение активности фермента по отношению к крысам группы НК на 20,9% (p<0,05); 32,2% (p<0,05) и 55,4% (p<0,05), в то время как применение ЭМГПМ в дозах 100 и 150 мг/кг повышало активность цитохром-с-оксидазы на 26,6% (p<0,05) и 49,2% (p<0,05) соответственно. При этом следует отметить, что активность анализируемых ферментов была достоверно выше у животных, получавших ЭМГПС в дозе 50 мг/кг, чем у крыс, которым вводили ЭМГПМ в аналогичной дозе.
При изучении влияния ЭМГПС и ЭМГПМ на изменение реакций клеточного метаболизма было установлено, что у крыс группы НК активность аэробного дыхания снизилась, а анаэробного — напротив, увеличилась по отношению к крысам группы ЛО на 58,5% (p<0,05) и в 6,1 раза (p<0,05) соответственно (см. табл. 2). Введение животным ЭМГПС способствовало активации аэробного обмена относительно нелеченых крыс на 28,8% (p<0,05) в дозе 50 мг/кг; на 52,3% (p<0,05) в дозе 100 мг/кг и на 62,4% (p<0,05) в дозе 150 мг/кг, при этом активность анаэробного метаболизма уменьшилась на 27,3% (p<0,05); 40,7% (p<0,05) и 45,2% (p<0,05) соответственно. Применение ЭМГПМ в дозах 100 и 150 мг/кг приводило к повышению реакций аэробного обмена на 30,2% (p<0,05) и 46,3% (p<0,05) соответственно, тогда как активность анаэробных процессов снизилась на 36,0% (p<0,05) и 42,2% (p<0,05) соответственно. Стоит отметить, что статистически значимых изменений аэробного и анаэробного метаболизма при применении ЭМГПМ отмечено не было (см. табл. 2).
Обсуждение
Известно, что ишемический инсульт является социально значимым заболеванием по ряду причин. Первостепенно это связано с высоким уровнем летальности и инвалидизации населения, а также с долгой и не всегда полноценной реабилитацией. В связи с этим поиск новых и совершенствование существующих методов лечения инсульта приобретает особую актуальность. Определенную терапевтическую нишу в лечении острого нарушения мозгового кровообращения занимают нейропротекторы-антиоксиданты [17], в частности янтарнокислая и яблочнокислая соли этилметилгидроксипиридина, которые демонстрируют высокий уровень эффективности и безопасности применения [18]. В то же время механизм действия данных средств является многофакторным и затрагивает различные звенья повреждения головного мозга при ишемии, например митохондриальную дисфункцию. В данном исследовании проведена сравнительная оценка влияния ЭМГПС и ЭМГПМ на изменение митохондриальной функции у крыс с фокальной ишемией головного мозга. При этом анализировалось изменение энергетической, апоптоз- и редокс-регулирующей функций митохондрий. В итоге было показано, что в случае применения как ЭМГПС, так и ЭМГПМ отмечается дозозависимый характер изменения функциональной активности митохондрий. В случае оценки редокс-регулирующей функции митохондрий (по изменению концентрации митохондриального пероксида водорода) наблюдался параболический характер действия, что является типичным для средств антиоксидантного действия [19], тогда как в остальных случаях наблюдалась линейная зависимость изменений. Также следует отметить уменьшение активности внутреннего пути апоптоза под влиянием ЭМГПС и ЭМГПМ, которое выражалось в снижении содержания АИФ. При этом в ходе анализа редокс- и апоптоз-регулирующей функции митохондрий статистически достоверных отличий между группами животных, которым вводили яблочную и янтарную соли этилметилгидроксипиридина, установлено не было. Однако в ходе оценки энергетической функции митохондрий были выявлены некоторые различия в характере действия ЭМГПС и ЭМГПМ. Так, введение животным янтарной соли в диапазоне доз 50, 100 и 150 мг/кг приводило к повышению митохондриальной активности, выражаемой в виде превалирования аэробного метаболизма над анаэробными реакциями, а также повышению активности сукцинатдегидрогеназы и цитохром-с-оксидазы. Применение ЭМГПМ в дозе 50 мг/кг не оказывало значимого влияния на изменение энергетической функции митохондрий, но с увеличением дозы происходило восстановление их функциональной активности. Возможно, данные изменения связаны с характером действия малат-аниона на изменение митохондриальной функции. Так, J. Wu и соавт. [20] показали, что экзогенный малат в высоких, но не низких дозах может способствовать активации малат-аспартатного шунта, способствующего поступлению в митохондрии восстановительных эквивалентов, что стабилизирует их активность [21]. В то же время сукцинат в низких дозах способен прямо активировать митохондриальный комплекс II, повышая в итоге интенсивность аэробных реакций обмена [9]. В связи с этим можно предположить, что воздействие на энергетическую функцию митохондрий янтарной и яблочной солей этилметилгидроксипиридина в низких дозах определяется характером аниона, тогда как в высоких дозах данное влияние утрачивается.
Заключение
Установлено, что применение ЭМГПС и ЭМГПМ в условиях фокальной ишемии головного мозга дозозависимо способствует повышению функциональной активности митохондрий. При этом введение как низких, так и высоких доз анализируемых препаратов приводит к равнозначному восстановлению редокс- и апоптоз-регулирующей функции митохондрий. Энергетическая функция митохондрий линейно увеличивается при введении ЭМГПС (в дозах 50, 100 и 150 мг/кг) и ЭМГПМ в высоких дозах (100 и 150 мг/кг), но не изменяется при применении низких доз (50 мг/кг) ЭМГПМ.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.