Введение
Верификация нозологической формы воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) при локализации процесса в толстой кишке по-прежнему остается серьезной диагностической проблемой [1]. Показано, что от 5% до 15% случаев ВЗК не отвечают строгим критериям как язвенного колита (ЯК), так и болезни Крона (БК), а у 14% пациентов с установленным диагнозом «ЯК» или «БК», диагноз со временем меняется [2].
Важность установления формы ВЗК определяется рядом аспектов. Показана различная эффективность препаратов при ЯК и БК. Так, аминосалицилаты в качестве варианта первой линии лечения и поддержания ремиссии более эффективны при ЯК, чем при БК. Метотрексат вызывал более высокую скорость ответной реакции при БК, чем при ЯК. Показана различная эффективность препарата Ведолизумаб (моноклональные антитела к интегрину альфа-4/бета-7) у пациентов с ЯК и БК [3]. Точный диагноз имеет существенное значение для разработки таргетных препаратов при выявлении специфических патогенетических механизмов в каскаде воспалительных процессов для снижения уровня побочных эффектов иммуномодуляции (злокачественных опухолей, инфекций и аллергических реакций), поддерживая при этом политику экономии средств [4]. Известно, что при хирургическом лечении ВЗК используется различная тактика в зависимости от нозологической формы — восстановительная проктоколэктомия с подвздошно-резервуаро-анальной реконструкцией при ЯК; экономная хирургическая резекция при развитии осложнений или временное выключение пораженного участка кишки из пассажа при БК; кроме того, применяются различные стратегии лечения при несвищевых перианальных поражениях [5].
Наконец, при оценке результатов терапии разных нозологических вариантов ВЗК используются различные критерии: при ЯК — контроль симптомов, заживление слизистой оболочки; при БК — совокупность признаков: заживление слизистой оболочки должно сочетаться с отсутствием трансмурального воспаления и внепросветных осложнений [6].
Поскольку «золотого стандарта» диагностики ВЗК, в том числе, дифференциальной, нет, диагноз основывается на совокупности результатов мультидисциплинарного исследования, включающего клиническую оценку и комбинацию эндоскопических, гистологических, лучевых и/или лабораторных методов. Вместе с тем данные эндоскопии и гистопатологической оценки биоптатов кишки не всегда позволяют верифицировать нозологическую форму ВЗК [7]. В клинической практике используют перечень биомаркеров для различения нозологических форм ВЗК, диагностическая точность которых варьирует. Уровень С-реактивного белка (СРБ) — маркера воспаления чаще повышен при активной БК, чем ЯК (~80% по сравнению с 50%) в связи с более глубоким поражением кишки при БК, более высоким уровнем IL-6. Но в то же время показано, что СРБ может коррелировать с клинической активностью и протяженностью поражения при ЯК [8].
Фекальный кальпротектин более тесно коррелирует с эндоскопической и симптоматической оценкой при ЯК, чем при БК, даже при исключении пациентов с только подвздошнокишечной БК. Но показано, что ни один из доступных фекальных биомаркеров (лейкоциты, меченные индием-111, кальпротектин, лактоферрин, эластаза полиморфноядерных гранулоцитов, неоптерин и белки S100A12) не может считаться полезным для дифференциальной диагностики у пациентов с ВЗК — колитом [9].
Для различения ЯК и БК используются иммунологические маркеры, в том числе перинуклеарные антинейтрофильные цитоплазматические антитела (pANCA) и антитела к дрожжам Saccharomyces cerevisiae (ASCA). ASCA идентифицируют пациентов с БК с высокой специфичностью (85—100%) и умеренной чувствительностью (39—76%), характеризуя фенотипы заболевания с поражением подвздошной кишки (LI, LIII), с образованием стриктур или проникающих осложнений, с молодым возрастом дебюта, а также с множественными операциями на кишечнике. pANCA чаще встречаются у пациентов с ЯК (20—85%), чем с БК (2—28%). Повышение pANCA более характерно для панколита при БК. Тесты ASCA+/pANCA— позволяли отличать взрослых пациентов с БК от больных с ЯК с чувствительностью 55% и специфичностью 93%, но при поражении только толстой кишки диагностическая точность снижалась [10].
Антигликановые антитела, такие как углеводные антитела к хитобиозиду, углеводные антитела к ламинарибиозиду, углеводные антитела к маннобиозиду, антихитин IgA (Anti-C) и анти-ламинарин IgA (Anti-L), обнаружены, по крайней мере, у каждого третьего пациента с БК из числа отрицательно реагирующих на ASCA, но их общая чувствительность в отношении БК была низкой (9—27%, 20—26%, 12—27%, 10—25% и 17—26% соответственно), особенно при поражении толстой кишки [11].
По данным европейского многоцентрового клинико-катамнестического исследования, у 48,5% пациентов с неклассифицируемым типом ВЗК получены отрицательные результаты анализов на ASCA и pANCA, у большинства из пациентов были клинические проявления, препятствующие установлению окончательного диагноза БК или ЯК в течение средней продолжительности заболевания 10,7 года [12]. Добавление тестов для I2 и антител к OmpC, помимо тестов ASCA и pANCA, существенно не увеличило способность классифицировать нозологическую форму ВЗК при неклассифицируемом колите, отмечено незначительное повышение прогностической способности при значительном снижении специфичности [13].
Таким образом, серологические тесты предоставляют дополнительные инструменты для различения БК и ЯК, хотя отмечена существенная неоднородность диагностической точности. Поэтому актуальность поиска новых подходов к дифференциальной диагностике нозологических форм ВЗК сохраняется.
Цель исследования — представить способ дифференциальной диагностики ВЗК в стадии обострения с использованием комбинированных моделей на основе совокупности параметров эритроцитов, маркеров воспаления, жирных кислот мембран эритроцитов и сыворотки крови.
Материал и методы
Обследован 91 пациент (49 женщин, 42 мужчины, средний возраст 37,7±12,1 года) с ВЗК в стадии обострения и 53 пациента группы сравнения (28 женщин, 25 мужчин, средний возраст 43,3±11,7 года). Группа пациентов с ВЗК включала в себя больных с ЯК — 50 человек, с БК — 41 человек. Диагноз верифицирован на основании сочетания данных анамнеза, клинической картины, типичных эндоскопических и гистологических изменений, лабораторных показателей в соответствии с клиническими рекомендациями по диагностике и лечению БК у взрослых и ЯК (2023) [14, 15].
В качестве группы сравнения (контроля) отобраны лица, проходившие профилактическое обследование, ведущие здоровый образ жизни, употребляющие алкоголь не чаще 1—2 раз в месяц в дозах, не превышающих 20 г в сутки в пересчете на чистый этанол, без манифестирующей патологии внутренних органов (всего 53 человека).
Исследование выполнено с одобрения комитета биомедицинской этики Научно-исследовательского института терапии и профилактической медицины — филиала ФГБНУ ИЦИГ СО РАН (Протокол №120 от 17.12.18). Все пациенты подписали информированное добровольное согласие на участие в исследовании.
Всем пациентам с ВЗК и обследуемым группы контроля выполнен общий анализ крови с использованием автоматического гематологического анализатора HTIMicroCC-20 Plus («HighTechnology, Inc.», США). Проанализированы следующие показатели красной крови: количество эритроцитов (×1012/л), уровень гемоглобина (г/л), гематокрит (%), скорость оседания эритроцитов (СОЭ) (мм/ч), средний корпускулярный объем эритроцита (MCV) (фл), среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH) (пг), средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах (MCHC) (г/л).
Методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием стандартных наборов ELISA («Cloud-Clone Corp.», США) на ИФА анализаторе Multiscan EX («Thermo Labsystem», Финляндия) определяли концентрации С-реактивного белка («Biomerica, Inc.», США) (мг/л), ферритина (мкг/л). Концентрации фибриногена в плазме крови (г/л) определяли клоттинговым методом по Клауссу [16].
У пациентов с ВЗК определяли содержание фекального кальпротектина (мкг/г) (белок нейтрофилов, маркер кишечного воспаления) методом ИФА («R-Biopharm», Германия) в KDL-лаборатории (референтные значения <50 мкг/г).
Исследование уровней жирных кислот (ЖК) мембран эритроцитов и сыворотки крови проведено с помощью газовой хроматографии/масс-спектрометрии — системы на основе трех квадруполей Agilent 7000B («Agilent Technologies, Inc.», США). Концентрации ЖК выражали в процентах относительно общего содержания жирных кислот в образце. Предел обнаружения ЖК ~1 мкг на образец. Подробное описание пробоподготовки для исследования ЖК и процесса их определения представлено ранее [17]. Кроме содержания отдельных ЖК, определяли суммарное содержание полиненасыщенных ЖК (ПНЖК), омега-3 ПНЖК, омега-6 ПНЖК, их соотношения.
Статистическая обработка данных выполнена с использованием программы SPSS, ver. 26. Определяли характер распределения количественных признаков методом Колмогорова—Смирнова. В случае нормального распределения вычисляли среднее значение (M) и стандартное отклонение (SD). При сравнении двух нормально распределенных выборок использовали t-тест Стъюдента. При отсутствии нормального распределения вычисляли медиану (Me), 25-й и 75-й процентили (25%; 75%) (Me [25%; 75%]); статистическую значимость различия показателей оценивали с помощью непараметрических критериев (U-критерий Манна—Уитни, Краскела—Уоллиса). Параметры эритроцитов, биохимические показатели, уровни жирных кислот по характеру распределения отличались, поэтому в таблицах для единообразия представления материала показаны и средние величины со стандартным отклонением (M±SD), и медиана с процентильным распределением Me [25%; 75%]. Во всех процедурах статистического анализа критический уровень значимости нулевой гипотезы (p) принимали равным 0,05. Формулы расчета диагностических индексов YD1 и YD2 получены с использованием библиотек анализа данных для Python (scikit-learn).
Результаты
Группы пациентов с разными нозологическими формами ВЗК сопоставимы по возрасту, полу, индексу массы тела, статусу курения. Во всех группах преобладали пациенты с настоящим обострением легкой или средней степени тяжести и со стажем заболевания более 2 лет, рецидивирующим течением средней степени тяжести с умеренной клинической, эндоскопической активностью. Преимущественная локализация процесса в толстой кишке при БК определила актуальность дифференциальной диагностики ВЗК. Пациенты с ЯК и БК оказались сопоставимыми по проводимой терапии.
В ходе исследования выявлены изменения показателей красной крови, концентрации сывороточных, фекальных маркеров воспаления, уровней жирных кислот мембран эритроцитов и сыворотки крови у пациентов с ВЗК, в том числе при разных нозологических формах. Основные результаты анализа параметров, значимых для построения диагностических панелей у пациентов с ВЗК и лиц группы сравнения (контроля), приведены в табл. 1, 2.
Таблица 1. Показатели красной крови, биохимические параметры у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника и у лиц группы контроля
| Показатели | Группа контроля (n=53) | Все пациенты с ВЗК (n=91) | Группа пациентов с ЯК в стадии обострения (n=50) | Группа пациентов с БК в стадии обострения (n=41) | Критерий Манна—Уитни р |
| Уровень гемоглобин, г/л | 141,3±8,59 141 [135,5; 146,3] | 121,3±17,5 120 [110; 133,25] | 119,42±17,3 119,0 [110; 129] | 118,06±18,11116,5 [106,5; 129] | p1—2=0,00001 p1—3=0,00001 p1—4=0,00001 p3—4=0,721 |
| Гематокрит, % | 42,98±2,44 43 [42; 44,5] | 39,42±4,14 39,5 [37; 42] | 39,15±3,74 39 [37; 42] | 38,32±4,68 38,5 [37; 41] | p1—2=0,00001 p1—3=0,00001 p1—4=0,00001 p3—4=0,524 |
| Средний корпускулярный объем эритроцита MCV, фл | 91,55±3,02 92 [90; 94] | 84,27±6,77 82 [79; 92] | 82,10±7,01 79 [78; 85] | 85,6±6,61 83,5 [80,5; 92,75] | p1—2=0,00001 p1—3=0,00001 p1—4=0,00001 p3—4=0,007 |
| Среднее содержание гемоглобина в эритроците MCH, пг | 30,85±2,03 31 [29; 33] | 28,45±3,23 28 [26; 30] | 27,44±2,9 27 [26; 29] | 28,63±3,31 28 [27, 31] | p1—2=0,0001 p1—3=0,0001 p1—4=0,0001 p3—4=0,05 |
| Средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах MCHC, г/л | 339,76±10,03 340 [335; 347] | 315±19,91 314 [305; 328] | 308,36±18,35 308 [299; 317,5] | 315,77±21,62 320,5 [305,75; 329,5] | p1—2=0,00001 p1—3=0,00001 p1—4=0,0003 p3—4=0,05 |
| СОЭ, мм/ч | 8,92±3,69 9 [6; 11] | 21,8±11,3 21 [12,5; 28] | 23,43±8,7 21 [18,75; 27,25] | 27,35±12,28 28 [21; 34] | p1—2=0,00001 p1—3=,00001 p1—4=0,00001 p3—4=0,05 |
| Ферритин, мкг/л | 87,78±57,99 68 [46,5; 121] | 43,89±40,41 29 [15,25; 67,25] | 35,23±31,39 25 [9,5; 57,5] | 59,02±48,88 41 [20,5; 84] | p1—2=0,00001 p1—3=0,00001 p1—4=0,0005 p3—4=0,014 |
| С-реактивный белок, мг/л | 2,27±0,84 2 [2; 3] | 12,85±11,34 10 [4; 19,5] | 11,05±8,41 10 [4; 16,5] | 19,93±13,1 18,5 [8; 28] | p1—2=,00001 p1—3=0,00001 p1—4=0,00001 p3—4=0,002 |
| Фибриноген, г/л | 2,68±0,65 3 [2; 3] | 5,07±1,88 5 [4; 6] | 4,62±1,1 5 [4; 5] | 6,72±1,94 7 [5,5; 7,5] | p1—2=0,00002 p1—3=0,0004 p1—4=0,00001 p3—4=0,0001 |
| Фекальный кальпротектин, мкг/г | 23,87±10,6 23 [23; 25] | 238,0±193,62 214 [54; 341] | 241,12±153,9 216,5 [114,5; 307] | 373,65±199,1 341 [242,25; 517,5] | p1—2=0,00001 p1—3=0,00001 p1—4=0,00001 p3—4=0,005 |
Примечание. Здесь и в табл. 2 данные представлены в виде M±SD, Me [25%; 75%]. ВЗК — воспалительные заболевания кишечника; ЯК — язвенный колит; БК — болезнь Крона.
Таблица 2. Уровни жирных кислот мембран эритроцитов, сыворотки крови у пациентов у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника и у лиц группы контроля
| Показатели | Группа контроля (n=53) | Все пациенты с ВЗК (n=91) | Группа пациентов с ЯК в стадии обострения (n=50) | Группа пациентов с БК в стадии обострения (n=41) | Критерий Манна—Уитни, p |
| Эр С18:1; c9 Цис-9-октадекановая (Олеиновая), % | 12,81±3,37 13,66 [10,85; 15,29] | 11,33±2,96 11,27 [9,38; 13,46] | 8,87±3,14 8,71 [6,65; 9,99] | 11,85±3,01 11,8 [10,37; 13,84] | p1—2=0,0031 p1—3=0,002 p1—4=0,04 p3—4=0,03 |
| C20:4; 5,8,11,14 (n-6) (Эйкозатетраеновая, арахидоновая), % | Содержание в мембранах эритроцитов | p1—2=0,021 p1—3=0,03 p1—4=0,02 p3—4=0,414 | |||
| 7,84±3,57 7,56 [6,14; 8,48] | 10,28±3,11 10,07 [7,84; 12,72] | 9,72±3,6 9,17 [7,44; 12,23] | 10,13±3,47 9,95 [8,19; 12,2] | ||
| Содержание в сыворотке крови | p1—2=0,05 p1—3=0,05 p1—4=0,02 p3—4=0,059 | ||||
| 4,21±1,83 4,18 [3,51; 5,78] | 4,92±1,65 4,86 [3,67; 5,86] | 4,63±1,64 4,65 [3,56; 5,22] | 5,42±1,62 5,21 [4,61; 6,97] | ||
| Суммарное содержание ПНЖК, % | Содержание в мембранах эритроцитов | p1—2=0,1277 p1—3=0,089 p1—4=0,115 p3—4=0,293 | |||
| 31,69±9,67 32,46 [24,16; 39,72] | 29,5±8,09 28,91 [24,28; 35,73] | 28,09±8,6 26,46 [22,85; 33,92] | 29,66±7,84 29,4 [24,48; 33,69] | ||
| Содержание в сыворотке крови | p1—2=0,0018 p1—3=0,0001 p1—4=0,0001 p3—4=0,785 | ||||
| 40,33±8,4 40,87 [34,41; 47,38] | 35,12±9,38 36,01 [27,13; 43,56] | 34,21±9,68 32,91 [26,63; 41,59] | 34,41±9,28 35,59 [27,04; 42,12] | ||
| Омега-6/Омега-3 ПНЖК в сыворотке крови | 15,24 ±7,37 13,76 [10,06; 20,40] | 21,87 ±12,81 16,75 [13,82; 31,34] | 18,98 ±6,56 18,33 [16,38; 19,40] | 22,36 ±8,15 22,69 [21,89; 23,09] | p1—2=0,0005 p1—3=0,04 p1—4=0,0003 p3—4=0,069 |
Примечание. ПНЖК — полиненасыщенные жирные кислоты.
Выявлено статистически значимое снижение уровня гемоглобина, гематокрита, среднего корпускулярного объема эритроцитов, среднего содержания и концентрации гемоглобина в эритроците, уровня ферритина (p<0,00001) у пациентов с ВЗК по сравнению с показателями у лиц группы контроля и, напротив, статистически значимое повышение уровня маркеров воспаления — СОЭ, СРБ, фибриногена, фекального кальпротектина (p=0,00001—0,00002). У пациентов с ЯК в стадии обострения были меньше показатели MCV (p=0,007), MCH (p<0,05), MCHC (p<0,05), СОЭ (p<0,05), уровни ферритина (p=0,014), СРБ (p=0,002), фибриногена (p<0,0001), фекального кальпротектина (p=0,005), чем у пациентов с БК в активной стадии.
Уровни олеиновой кислоты в мембранах эритроцитов (p=0,0031), суммарное содержание ПНЖК в сыворотке крови (p=0,0018) оказались ниже, а содержание арахидоновой кислоты в мембранах эритроцитов (p=0,021), сыворотке крови (p<0,05), отношение омега-6/омега-3 ПНЖК (p=0,0005) — выше у пациентов с ВЗК по сравнению с лицами группы контроля. Пациенты с разными нозологическими формами ВЗК статистически значимо различались лишь по содержанию олеиновой кислоты в мембранах эритроцитов (p=0,03).
Для различения групп пациентов с ВЗК и обследуемых группы контроля, а также нозологических форм ВЗК — ЯК и БК в стадии обострения — с учетом показателей красной крови, серологических, фекальных маркеров воспаления, уровней ЖК мембран эритроцитов и сыворотки крови в ходе экспериментальных исследований получены формулы М1 и М2 расчета диагностических индексов YD1 и YD2:
YD1= 1/[1+exp(—SD1)], (1)
где
SD1= –0,0068×Hb+0,2219×СОЭ– 0,0101×Фер+0,1138×ФКП–0,4724×эрОлК+ 0,0409×эрАраК+0,4365×сАраК+(2) 0,0136×эрПНЖК–0,0215×сПНЖК– 0,0083×cO6/O3
YD2=1/[1+exp(–SD2)], (3)
где
SD2= –0,014×Hb+0,1751×Ht–0,0212×MCV– 0,2974×MCH+0,0334×MCHC+0,0516×СОЭ+(4) 0,005×Фер–0,0342×СРБ–1,1244×ФГ+ 0,0014×ФКП–0,0328×эрОлК,
где Hb — уровень гемоглобина, г/л; Ht — гематокрит, %; MCH — среднее содержание гемоглобина в эритроците, пг; MCHC — средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах, г/л; MCV — средний корпускулярный объем эритроцита, фл; cO6/O3 — отношение содержания омега-6 к омега-3 ПНЖК в сыворотке крови; сАраК — содержание арахидоновой кислоты в сыворотке крови C20:4n-6, %; СОЭ — скорость оседания эритроцитов, мм/ч; сПНЖК — суммарное содержание ПНЖК в сыворотке крови, %; СРБ — С-реактивный белок, мг/л; ФГ — фибриноген, г/л; Фер — ферритин, мкг/л; ФКП — фекальный кальпротектин, мкг/г; эрАраК — содержание арахидоновой кислоты в эритроцитах C20:4n-6, %; эрОлК — содержание олеиновой кислоты в эритроцитах C18:1; c9,%; эрПНЖК — суммарное содержание ПНЖК в эритроцитах, %.
При значении диагностического индекса YD1, превышающем 0,66, принимают решение о вероятности наличия воспалительного заболевания кишечника; при значении диагностического индекса YD2, превышающем 0,5, принимают решение о вероятности наличия ЯК, менее 0,5 — о вероятности наличия БК.
Состав диагностических панелей представлен в табл. 3. В состав модели М1 для различения пациентов с ВЗК и обследуемых группы контроля вошли уровни гемоглобина, гематокрита, СОЭ, ферритина, фекального кальпротектина, олеиновой кислоты мембран эритроцитов, эритроцитарной и сывороточной арахидоновой кислоты, суммарного содержания ПНЖК, сывороточного отношения омега-6/омега-3 ПНЖК (при пороговом значении диагностического индекса YD=0,66 для данной модели М1 достигнута высокая диагностическая точность 0,968, чувствительность 0,974, специфичность 0,941).
Таблица 3. Состав диагностических моделей для дифференцирования пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника и здоровых лиц (M1), пациентов с язвенным колитом и пациентов с болезнью Крона (M2)
| Показатели | Модели | |
| M1 (здоровые по сравнению с ВЗК) | M2 (ЯК по сравнению с БК) | |
| Уровень гемоглобина, г/л | –0,0068 | –0,0140 |
| Гематокрит, % | — | 0,1751 |
| Средний корпускулярный объем эритроцита MCV, фл | — | –0,0212 |
| Среднее содержание гемоглобина в эритроците MCH, пг | — | –0,2974 |
| Средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах MCHC, г/л | — | 0,0334 |
| СОЭ, мм/ч | 0,2219 | 0,0516 |
| Ферритин, мкг/л | –0,0101 | 0,0050 |
| С-реактивный белок, мг/л | — | –0,0342 |
| Фибриноген, г/л | — | –1,1244 |
| Фекальный кальпротектин, мкг/г | 0,1138 | 0,0014 |
| Эр С18:1; c9 Олеиновая, % | –0,4724 | –0,0328 |
| Эр С20:4 n-6 Арахидоновая, % | 0,0409 | — |
| Сыв. С20:4 n-6 Арахидоновая, % | 0,4365 | — |
| Эр. сумма ПНЖК, % | 0,0136 | — |
| Сыв. Сумма ПНЖК, % | –0,0215 | — |
| Сыв. Омега-6/Омега-3 ПНЖК | –0,0083 | — |
Модель М2 для дифференцирования пациентов с ЯК и БК в стадии обострения включала уровни гемоглобина, гематокрита, MCV, MCH, MCHC, СОЭ, ферритина, С-реактивного белка, фибриногена, фекального кальпротектина и олеиновой кислоты мембран эритроцитов, обеспечивая при пороговом значении диагностического индекса YD=0,5 для второй модели М2 диагностическую точностью 0,891, чувствительность 0,993, специфичность 0,887.
Характеристики диагностической точности для моделей M1 и M2 приведены в табл. 4, на рисунке представлены установленные пороговые значения индексов.
Таблица 4. Характеристики точности созданных моделей
| Модели | Пороговое значение YD | AUC | Специфичность | Чувствительность | Диагностическая точность |
| M1 | 0,66 | 0,957 | 0,941 | 0,974 | 0,968 |
| M2 | 0,50 | 0,887 | 0,840 | 0,993 | 0,891 |
Пороговые значения индексов.
а — для различения пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника и здоровых лиц; б — для различения пациентов с язвенным колитом и пациентов с болезнью Крона.
Предложенный способ с использованием комбинированных моделей, включающих показатели красной крови, маркеры воспаления, уровни жирных кислот мембран эритроцитов, сыворотки крови, с высокой диагностической точностью обеспечивает выявление наличия воспалительного заболевание кишечника у пациента, при подтверждении диагноза ВЗК — установление наиболее вероятной нозологической формы заболевания для разработки дальнейшей тактики ведения, лечения пациента, определения прогноза. Данный метод является малоинвазивным, безопасным, приемлемым для пациента и врача, доступным по перечню исследуемых параметров, не требующим больших финансовых затрат, может быть выполнен в условиях медицинских и научных учреждений, в том числе, для скрининга больших групп населения.
Обсуждение
Предложенный способ дифференциальной диагностики ВЗК предполагает последовательное использование двух диагностических моделей, первая из которых позволяет установить наличие ВЗК, а вторая — с высокой степенью вероятности сделать вывод о наличии ЯК или БК. Следует заметить, что в ходе проведения исследования построено более 100 моделей с различными сочетаниями параметров, из которых представленные были оптимальными по диагностической точности.
Преимущества созданных панелей заключаются в том, что они состоят из показателей, доступных в рутинной клинической практике, то есть показателей красной крови, получаемых при использовании гематологического анализатора, маркеров воспаления, определяемых стандартными методами, и содержания наиболее значимых жирных кислот, определяемых в клинических лабораториях. Использование в диагностических моделях описанных выше показателей патогенетически обоснованно. Различные параметры красной крови входят в состав диагностических индексов ВЗК для объективизации состояния пациента [14, 15]: количество эритроцитов, уровень гемоглобина, гематокрит и СОЭ включены в число критериев, определяющих тяжесть атаки при БК (критерии Общества по изучению ВЗК, индекс Беста), при ЯК (критерии Truelove—Witts), наличие анемии и ее степень входят в число клинических проявлений ВЗК; исследование развернутого анализа крови, показателей обмена железа, уровня фолиевой кислоты, витамина B12 рекомендовано при проведении дифференциальной диагностики анемий при ВЗК [14, 15].
Использование в моделях маркеров воспаления обосновано возможностью объективизировать наличие активного воспалительного процесса. Но вместе с тем ряд показателей (С-реактивный белок, СОЭ, ферритин) используются для дифференцирования железодефицитной анемии, в большей степени ассоциированной с ЯК, от анемии воспалительных заболеваний, преимущественно наблюдаемой при БК [18]. Таким образом, маркеры воспаления оказываются полезными и с точки зрения дифференциальной диагностики нозологических форм ВЗК. Фекальный кальпротектин является маркером связи имеющегося воспаления с кишкой.
Среди перечня жирных кислот, определенных при проведении настоящего исследования, наиболее значимыми для диагностики оказались олеиновая, арахидоновая кислоты, суммарное содержание ПНЖК и отношение содержания омега-6 к омега-3 ПНЖК. Их роль в различении пациентов с ВЗК от здоровых, в установлении различий между нозологическими формами ВЗК не случайна.
Метаболизм арахидоновой кислоты, известный как «арахидоновый каскад», ассоциирован с синтезом биоактивных эйкозаноидов, таких как простагландины, лейкотриены, тромбоксаны и липоксины, участвующие в воспалении и агрегации тромбоцитов [19], в том числе у пациентов с ВЗК. P. Sharon и соавт., D.W. Hommes и соавт. выявили повышенное содержание лейкотриенов и простагландинов в слизистой оболочке кишечника у пациентов с БК [20, 21], что авторы связали с активностью настоящей атаки. D.S. Pearl и соавт. показано, что воспаленная слизистая оболочка толстой кишки у пациентов с ЯК характеризуется более высокой концентрацией арахидоновой кислоты и более низким содержанием эйкозапентаеновой кислоты [22]. J. Kikut и соавт. продемонстрировали активный метаболизм арахидоновой кислоты с повышением уровня ее производных — гидроксиэйкозатетраеновых кислот, тромбоксана B2, лейкотриена B4 и гидроксиоктадекадиеновой кислоты — при активных ЯК и БК [23].
E.A. Scoville и соавт. выявили ассоциации уровня сывороточных жирных кислот у пациентов с БК с цитокинами сыворотки и активностью заболевания [24]. D.M. Wiese и соавт. установлено, что содержание сывороточных жирных кислот коррелирует с уровнями провоспалительных цитокинов в толстой кишке у пациентов с ЯК [25].
C. Ma и соавт. показано, что длинноцепочечные жирные кислоты оказывают воздействие на процесс воспаления в кишечнике при ВЗК, влияя на распознавание патогенов, инфильтрацию слизистой оболочки кишки и функцию иммунных клеток наряду с этапом разрешения воспаления [26].
Изученные механизмы заключаются в том, что ЖК защищают или ослабляют кишечные барьеры, стимулируют или ингибируют сигнальные пути TLR/NOD и влияют на баланс между провоспалительным и противовоспалительным факторами транскрипции — NF-κB и PPAR-γ. W. Cao и соавт. экспериментальным путем доказали, что омега-3 ПНЖК дозозависимо повышают, а омега-6 ПНЖК снижают содержание компонентов плотных контактов кишечного барьера (окклюдин, клаудины, белок плотного соединения 1-го типа и молекулы адгезии к соединениям) [27]. Кроме того, омега-3 ПНЖК вместе с рядом насыщенных длинноцепочечных ЖК стимулируют выработку кишечных муцинов [28]. Известно, что toll-подобные рецепторы (TLRs) играют решающую роль в иммунном ответе, распознавая вспомогательные структуры молекул патогена. Показано, что омега-3 ПНЖК и омега-9 ПНЖК (включая, олеиновую ЖК) усиливают регуляцию генов TLR-2 и TLR-4 соответственно при TNBS-индуцированном колите, в то время как омега-6 ПНЖК влияют на высокомобильную группу box 1 (HMGB1), реактиватор гена TLR [29]. Высокое содержание омега-3 ПНЖК снижает активность воспаления при ВЗК, ингибируя сигнальные пути TLR4/NOD, в то время как омега-6 ПНЖК усиливают их стимуляцию [30].
В работах K.L. Honda и соавт., T.E. Novak и соавт. продемонстрировано, что длинноцепочечные ЖК могут воздействовать на экспрессию NF-κB в иммунных клетках, влияя на запуск воспаления [31, 32]. По данным A. Hassan и соавт., альфа-линоленовая, эйкозапентаеновая, докозагексаеновая кислоты снижают экспрессию TNF-α, LTB4 и COX-2 путем ингибирования активности NF-κB у крыс с TNBS-индуцированным колитом [33], однако документально не подтверждено, что олеиновая кислота (омега-9 ПНЖК) оказывает подавляющий эффект на активность колита по этому пути [34]. Экспериментальные исследования, выполненные R. Marion-Letellier и соавт., продемонстрировали, что конъюгированная линолевая, эйкозапентаеновая, докозагексаеновая кислоты, действуя как агонисты рецепторов PPAR-γ, способствуют купированию воспаления при ВЗК [35].
Важным аспектом является участие длинноцепочечных ЖК в регуляции функций иммунных клеток при ВЗК. Омега-6 ПНЖК снижают экспрессию продукции хемоаттрактанта C-X-C мотив лиганда-1 (CXCL1) и C-C мотив лиганда-2 (CCL2) при ишемическом/реперфузионном повреждении кишечника [36], а омега-3 ПНЖК ингибируют выработку хемокинов, в частности IL-8 (CXCL8) [35]. Благоприятные эффекты n-3 ПНЖК также подтверждены in vivo: докозагексаеновая и эйкозапентаеновая ЖК вызывают снижение уровней VCAM-1 и ICAM-1, ингибируя трансэпителиальную миграцию полиморфноядерных нейтрофилов у мышей с TNBS [37]. Многие исследователи предполагают, что функции дендритных клеток (промежуточное звено между идентифицированной экзогенной информацией и Т-лимфоцитами) могут модулироваться ПНЖК путем регулирования структуры молекул клеточной поверхности. С одной стороны, омега-3 ПНЖК могут подавлять экспрессию CD69 и CTLA-4 на Т-лимфоцитах, что снижает иммунный ответ дендритных клеток [38, 39]. С другой стороны, обнаружено, что ПНЖК снижают экспрессию MHC-II в дендритных клетках кишечника, тем самым уменьшая их антиген-представляющую способность [40]. Напротив, PGE2, производное омега-6 ПНЖК, повышает уровень ко-стимулирующих молекул как на дендритных клетках, так и на Т-лимфоцитах, включая OX40 и CD70, и индуцирует пролиферацию Т-клеток [41, 42]. Кроме того, различные соотношения омега-3 и омега-6 ПНЖК по-разному влияют на баланс Т-хелперов и Т-регуляторных клеток в модели ВЗК [43]. Это обеспечивает изменение роли ПНЖК в зависимости от активности воспаления в кишке (острое и хроническое), его локализации [44].
B.D. Rockett и соавт. показано снижение экспрессии CD69 — маркера активации B-клеток более чем на 40% при воздействии на B-клетки в течение 48 часов пальмитиновой и олеиновой кислотами [45]. Омега-3 ПНЖК влияют на кластеризацию микродоменов липидного рафта B-клеток, изменяя их трансмембранную сигнализацию и функцию [46].
Следует учитывать и роль ПНЖК в разрешении воспаления у пациентов с ВЗК. Производные омега-3 ПНЖК являются предшественниками большинства прорезольвиновых липидных медиаторов, включая резольвины, протектины и марезины, которые блокируют транспорт нейтрофилов, индуцируют фагоцитоз и очищают апоптотические клетки [47]. Резольвины из омега-6 ПНЖК и омега-3 ПНЖК не только поддерживают фагоцитоз макрофагов, но и поляризуют макрофаги в сторону М2 фенотипа, типа прорезольвиновых макрофагов [48]. A. Ariel и соавт. установлено, что производные ПНЖК могут обладать терапевтическим потенциалом для устранения устойчивого воспаления путем стимуляции образования аутофагосом и фагоцитоза апоптотических полиморфноядерных нейтрофилов [49].
Метаболизм ПНЖК в значительной степени определяется активностью десатураз, которая контролируется по принципу субстратного регулирования [19]. Данный процесс нарушен при обострении ВЗК, причем при активной БК в большей степени, чем при ЯК, сказываясь на общем содержании ПНЖК в сыворотке крови, мембранах эритроцитов [50].
Данные K. Uchiyama и соавт. показали важность поддержания индекса омега-3/омега-6 более 0,65 у пациентов с ЯК для индуцирования ремиссии заболевания [51]. Обнаружено, что повышенная заболеваемость ВЗК ассоциирована с западно-ориентированным питанием (более высокое соотношение омега-6/омега-3 ПНЖК и обилие насыщенных длинноцепочечных жирных кислот) [52]. Повышенные уровни соотношения омега-6/омега-3 у пациентов с ЯК и БК, а также возможная патогенетическая роль этого индекса при разных нозологических формах ВЗК отмечена E. Scaioli и соавт. [30], чем, вероятно, определяется его значимость в созданных диагностических моделях.
В проведенных ранее исследованиях нами созданы модели для целей дифференциальной диагностики, включающие большой перечень жирных кислот мембран эритроцитов, сыворотки крови, определение которых может быть затратным [53]. В настоящих комбинированных моделях использовано ограниченное количество наиболее диагностически значимых ЖК — биомаркеров, доступных для определения в клинических лабораториях, что повысит применимость данного подхода в клинической практике.
Большая часть диагностических индексов, используемых при ВЗК, предполагает оценку комплекса показателей, доступных в большей или меньшей степени. Так, общепринятыми являются критерии достоверного диагноза БК по Lennard-Jones, включающие определение семи ключевых признаков заболевания по данным эндоскопического и гистологиеского исследования [15]. Индекс активности ЯК по шкале Мейо также предполагает эндоскопическую оценку состояния слизистой [14], что ограничивает возможности использования индексов в период обострения ВЗК в связи с инвазивностью.
Поэтому поиски новых методов диагностики ВЗК продолжаются. А.П. Топтыгиной и соавт. предложен метод диагностики БК у детей [54]. Согласно данному способу, в биоптате слизистой оболочки кишки определяют содержание новообразованных лимфоидных узелков с перифокальным фиброзом, наличие дистрофически измененных эпителиальных клеток, адгезию лимфоцитов к апикальной мембране эпителия и образование невромоподобных структур и при выявлении тетрады признаков диагностируют БК. Предложенный способ дифференциальной диагностики ВЗК, основанный на морфологических показателях состояния слизистой оболочки кишечника, является более объективным, чем визуальная оценка. Однако данный метод является инвазивным, трудоемким, длительным, требует высокой квалификации морфолога, осуществим только с использованием эндоскопического исследования и биопсии. Точность его составила 70—80%. Поскольку БК может локализоваться во всех отделах желудочно-кишечного тракта, включая тонкую кишку, желудок и пищевод, для морфологического исследования необходимо получить биоптаты в разных участках желудочно-кишечного тракта, что является травматичной процедурой. Более щадящими и предпочтительными являются способы диагностики, основанные на анализе крови больного или фекальных маркеров.
В литературе имеются данные о создании диагностических моделей для пациентов с ВЗК, в которых также использована совокупность показателей. Так, Э.Н. Федуловой и соавт. представлен алгоритм дифференциальной диагностики ЯК и БК у детей на разных этапах медицинской помощи на основе математической оценки клинико-анамнестических и лабораторно-инструментальных данных [55]. Недостатком представленного подхода является необходимость оценки широкого перечня показателей в виде суммы баллов, в том числе данных эндоскопии, гистологии, ультразвуковых и клинических данных, что дорого, трудоемко и требует затрат времени. Кроме того, представленный алгоритм ассоциирован с детским возрастом и не проверен для взрослых пациентов с ВЗК.
Д.В. Печкуровым и соавт. предложен «Способ дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника у детей по комплексу клинико-анамнестических, лабораторных и инструментальных критериев» [56]. Суть метода заключается в том, что у пациента оценивают в баллах перечень показателей: клинических (боль в животе, кровь, слизь в стуле, неоформленный стул, ночная диарея, повышение температуры тела, дефицит массы тела, внекишечные проявления, поражение глаз в сочетании со стоматитом, снижение линейного роста, астеновегетативный синдром), анамнестических (отягощенная наследственность по аутоиммунной патологии), лабораторных (лейкоцитоз, анемия, скрытая кровь в кале, повышенный уровень кальпротектина, диспротеинемия), инструментальных (эндоскопические признаки эрозивного гастрита/дуоденита). Баллы по каждому параметру суммируются, затем сравнивают суммарные баллы с опорными показателями, ассоциированными с отдельными нозологическими формами ВЗК — ЯК, БК, неклассифицируемым колитом. Недостатками данного способа являются обширный перечень показателей, существенная доля которых оценивается субъективно (клинические параметры), необходимость выполнения большого количества лабораторных и инструментальных исследований, что дорого, требует времени, специального оборудования. Кроме того, предложенный метод рассматривается только у детей с ВЗК, он не адаптирован для взрослых с данной патологией.
Известен способ диагностики с использованием набора синтетических олигонуклеотидов, позволяющих выявлять маркерные участки генов бактерий, кодирующих бета-лактамазу, фимбриальный белок, 3 гипотетических белка и ген LrgA, ассоциированных с ВЗК [57]. Данный набор включает специфичные олигонуклеотиды к фрагментам генов микроорганизма Escherichia coli, а именно ряд определенных праймеров. Однако индивидуальный спектр кишечной микрофлоры сильно колеблется, а выявление той или иной микрофлоры не является основанием для верификации диагноза ВЗК.
Получен патент на диагностику ВЗК с помощью ультразвукового исследования (УЗИ) [58]. Так, проводят УЗИ с определением двух ультразвуковых показателей: показатель ультразвуковой компрессионной эластографии (КЭ) и показатель межпетлевого асцита (МА). Далее проводят расчет классификационных значений меток: «Нет ВЗК» и «Есть ВЗК» последовательно по двум оригинальным математическим формулам. Однако заявленные параметры являются признаками воспаления в стенке кишки, далеко не все показатели наблюдаются у каждого пациента с ВЗК и не обнаруживаются при другой этиологии воспаления кишечника.
Обширный перечень показателей и разнообразие подходов к диагностике ВЗК, включая дифференциальную диагностику, свидетельствуют об актуальности рассматриваемой проблемы.
Заключение
В ходе экспериментальных исследований получены формулы М1 и М2 расчета диагностических индексов YD1 и YD2 с использованием библиотек анализа данных для Python (scikit-learn). Для различения пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника и обследуемых группы сравнения (контроля) создана модель М1, включающая уровни гемоглобина, гематокрита, СОЭ, ферритина, фекального кальпротектина, олеиновой кислоты мембран эритроцитов, эритроцитарной и сывороточной арахидоновой кислоты, суммарного содержания полиненасыщенных жирных кислот, сывороточного отношения омега-6/омега-3 полиненасыщенных жирных кислот — с диагностической точностью 0,968, чувствительностью 0,974 и специфичностью 0,941 при пороговом значении диагностического индекса YD1 0,66. Модель М2, состоящая из уровней гемоглобина, гематокрита, MCV, MCH, MCHC, СОЭ, ферритина, C-реактивного белка, фибриногена, фекального кальпротектина и олеиновой кислоты мембран эритроцитов, обеспечила дифференцирование пациентов с активными язвенным колитом и болезнью Крона с диагностической точностью 0,891, чувствительностью 0,993 и специфичностью 0,887 при пороговом значении диагностического индекса YD2 0,50.
Предлагаемый способ с высокой диагностической точностью позволяет исключить наличие воспалительных заболеваний кишечника, установить вероятность определенной нозологической формы, что имеет большое значение для тактики ведения пациента, лечения, прогноза. Данный способ является малоинвазивным, безопасным, не требующим больших финансовых затрат, приемлемым для пациента и врача, может быть выполнен в условиях медицинских и научных учреждений, в том числе для скрининга больших групп населения.
Работа выполнена по Государственному заданию в рамках бюджетной темы FWNR-2022-0024.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Кручинина М.В., Осипенко М.Ф., Яковина И.Н.
Сбор и обработка материала — Кручинина М.В., Громов А.А., Валуйских А.И.
Статистический анализ данных — Яковина И.Н., Осипенко И.В.
Написание текста — Кручинина М.В., Осипенко М.Ф., Яковина И.Н.
Редактирование — Кручинина М.В., Громов А.А., Яковина И.Н., Валуйских А.И.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Authors contribution:
Study design and concept — Kruchinina M.V., Osipenko M.F., Yakovina I.N.
Data collection and processing — Kruchinina M.V., Gromov A.A., Valuyskikh A.I.
Statistical analysis — Yakovina I.N., Osipenko I.V.
Text writing — Kruchinina M.V., Osipenko M.F., Yakovina I.N.
Editing — Kruchinina M.V., Gromov A.A., Yakovina I.N., Valuyskikh A.I.