Подростковый период — вторая декада жизни человека, когда закладывается физический, психологический, репродуктивный базис для последующей эффективной жизни. Анализ состояния здоровья детей и подростков России свидетельствует о росте заболеваемости, увеличении распространенности хронической патологии, снижении числа здоровых детей во всех возрастно-половых группах [1, 2]. Подростковый возраст входит в один из критических периодов развития риска ожирения — превалирующее число подростков, имеющих избыточную массу тела, сохраняют ее и во взрослом возрасте [3, 4]. Доказано, что повышенный индекс массы тела (ИМТ) в подростковом возрасте более связан с увеличением смертности от всех причин во взрослой жизни, чем повышенный взрослый ИМТ [5, 6].

Ожирение — это состояние, обусловленное в основном изменением потребления энергии, смещением в сторону положительного энергетического баланса, на которое могут влиять генетические и экологические факторы. Фундаментальная роль микробиоты кишечника в регуляции и патогенезе метаболических нарушений в последние годы привлекает все больший интерес исследователей. Предполагается, что изменения нормального состава кишечной микрофлоры (дисбиоз) не только влияют на развитие функциональных расстройств органов пищеварения, но и являются еще одним фактором, способствующим возникновению ожирения [7, 8].

Род Bifidobacterium относится к типичным представителям здоровой микрофлоры человека, и изменения в количестве и составе бифидобактерий являются одним из симптомов дисбиоза кишечника. Знание состава бифидофлоры у подростков с различным ИМТ может быть использовано в качестве индикатора состояния здоровья, а также для подбора пребиотиков и пробиотических добавок в рационе для модификации кишечной микрофлоры при ожирении [8]. Внедряемые с 1990-х годов молекулярные методы стали центральным инструментом для изучения сложнокультивируемых бифидобактерий, позволив охарактеризовать геномный состав, таксономические, морфологические, физиологические особенности бифидобактерий [9]. По данным Е.В. Ивановой [10], бифидобактерии характеризуются генетической однородностью и консервативностью генома вследствие длительной коэволюции и высокой специализации к биотопу толстого кишечника человека, наиболее чувствительны к изменениям микроэкологических условий и тем самым являются наилучшими кандидатами на роль биомаркеров состояния этого биотопа.

Цель исследования — сравнительное изучение молекулярно-генетическими методами состава бифидофлоры в кишечнике подростков с ожирением и подростков из контрольной группы для выявления потенциальных микробных характеристик ожирения.

Материал и методы

Образцы биологического материала были получены из клиники ФГБНУ «Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека» (НЦ ПЗСРЧ). Подростки с ожирением и нормальной массой тела были разделены на две группы по данным перцентильных таблиц или стандарных отклонений: подростки с ожирением — Standard Deviation Score (SDS) body mass index (BMI) = 2,8±0,6 и группа контроля — SDS BMI = 0,008±0,5 [11, 12]. Возраст обследованных — от 11 до 16 лет. Сравнение между группами представлено в табл. 1.

Таблица 1. Сравнительная характеристика обследованных групп

Примечание. Индекс массы тела = кг/м², где кг — масса тела в килограммах, м — рост в метрах; SDS BMI — стандартное отклонение индекса массы тела; * — разница значима между группами (U_Эмп=0, p=0,0000001).

Пробы фекалий отбирали, транспортировали и хранили согласно стандартным операционным процедурам (Standard operating procedure — SOP) IHMS_SOP 03 V2, разработанным в рамках проекта International Human Microbiome Standards (IHMS) [13]. Геномную ДНК из фекалий выделяли коммерческим набором Qiagen Genomic Stool DNA isolation («Qiagen», Германия) согласно инструкции производителя и с модификациями согласно протоколу IHMS_SOP 06 V2. Качество ДНК оценивали в 1% агарозном гель-электрофорезе, концентрацию — на спектрофотометре NanoDrop («Thermo Scientific Scientific», США).

Проводили метагеномный анализ V3—V4 вариабельных районов гена 16S рРНК, длина фрагмента составила 466 п.н. (компания «Novogene», КНР) [14]. По результатам метасеквенирования всего было получено 2 590 453 прочтения, количество чтений в отдельных образцах до фильтрации варьировало от 70 356 до 89 825. После фильтрации некачественных прочтений, дерепликации, удаления химерных последовательностей в анализ оставили от 52 945 до 77 290 чтений в отдельных образцах, окончательно все библиотеки были нормализованы по библиотеке с минимальной частотой (52 945). Дальнейшую биоинформационную обработку данных и филогенетический анализ проводили, как описано ранее [15]. Нуклеотидные последовательности, используемые в данной работе, были депонированы в международную базу данных NCBI GenBank под номерами MN560070—MN560080.

Видовую детекцию бифидобактерий проводили методом ПЦР с пятью парами видоспецифичных праймеров, комплементарных гену 16S рРНК (B. longum, B. bifidum, B. infantis, B. adolescentis, B. catenulatum) с электрофоретической детекцией результата амплификации. Подробные методики описаны ранее [16]. Молекулярные исследования проводили на базе Центра коллективного пользования «Центр разработки прогрессивных персонализированных технологий здоровья» ФГБНУ «НЦ ПЗСРЧ», Иркутск.

Статистическая обработка данных произведена при помощи лицензионных прикладных программ MS Excel 2007 for Windows 7. Так как по критерию Шапиро—Уилка исследуемые выборки не подчиняются закону нормального распределения, для оценки достоверности различий между двумя группами по уровню какого-либо признака применяли непараметрические критерии: Критерий Фишера, χ², U-критерий Манна—Уитни. Для качественных переменных рассчитывались абсолютные и относительные (процентные) величины (при p<0,05 различия считали статистически значимыми).

Результаты

Идентификация бифидобактерий по V3—V4 вариабельным участкам гена 16S рРНК

Всего было выделено 28 890 филотипов (ASV), при этом их количество в каждом образце изменялось от 342 до 564. Таблица частот была нормализована по библиотеке с минимальной частотой (52 945). Оценка глубины секвенирования с использованием аппроксимирования Михаэлиса—Ментен показала, что состав микробиомов на уровне ASV в среднем был недооценен на 2,04%.

Сравнительный анализ метагеномных данных, полученных по V3—V4 вариабельному району гена 16S рРНК, с референсной базой данных SILVA 132 показал, что в среднем доля актинобактерий в микробиомах составляла 1,9%, среди которых доминировали бифидобактерии (1,2% в общем микробиоме). В группе контроля доля актинобактерий варьировала от 0,1 до 21,8% от общей доли всех бактерий в кишечном микробиоме, в группе подростков с ожирением доля актинобактерий была ниже и находилась в диапазоне от 0,1 до 3,2%.

Согласно метагеномным данным, было выделено 9 филотипов (ASV) бифидобактерий, соответствующих виду или роду, на долю которых в общем микробиоме приходилось суммарно в среднем 1,2%, а в индивидуальных образцах доля каждого филотипа варьировала от 0,002 до 1,15%. Назначение таксономии по референсной базе данных SILVA позволило идентифицировать до вида только филотип 5cd2 как B. bifidum, два филотипа были отнесены к неидентифицированным бактериями рода Bifidobacterium, а шесть — к некультивируемым бактериям. Филогенетическая реконструкция на основе анализа последовательностей гена 16S рРНК позволяет распознать плохо разрешенные таксоны и дать их классификацию [17]. Для филогенетического анализа использовали валидно зарегистрированные последовательности типовых штаммов [18]. Филогенетическая идентификация V3—V4 вариабельных участков последовательностей гена 16S рРНК, исследуемых в данной работе, и типовых штаммов бифидобактерий позволила определить до вида шесть ASV (a516, 5cd2, b956, 8881, ab65 и bc14), до рода три ASV (43e3, d7ab и 702с) (рис. 1).

Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное по V3—V4 вариабельным фрагментам гена 16S рРНК для филотипов, отнесенных к роду Bifidobacterium, и типовых штаммов бифидобактерий.

Наиболее высокая доля в составе кишечного микробиома отмечена для 6 филотипов бифидобактерий, распределение которых у подростков 2 групп представлено на рис. 2.

Рис. 2. Распределение наиболее представленных филотипов, идентифицированных как бифидобактерии, в кишечных микробиомах подростков с ожирением и группы контроля.

43e3-Bcat — B. catenulatum; 5cd2-Bbif — B. bifidum; 702c-Bif — бифидобактерии, идентифицированные до рода; a516-Ban — B. angulatum; Bl — B. longum; d7ab-Bad — B. adolescentis

Метагеномные данные могут быть использованы для количественной оценки определенных филотипов в пределах двух анализируемых групп [19]. Для сравнения относительной количественной представленности бифидобактерий между группами было рассчитано количество копий гена 16S рРНК бифидобактерий на геном. В качестве порогового значения принималось минимальное количество копий гена выше 50, что является равным 10 клеткам бифидобактерий в 100 мкг материала, взятого в метагеномный анализ ампликонов. Анализ показал, что частота встречаемости образцов, количество копий гена в которых было >50, значимо выше в группе контроля (рис. 3).

Рис. 3. Распределение частоты встречаемости числа копий гена 16S рРНК бифидобактерий в разных группах подростков.

* — количество копий >50 значимо выше в группе контроля (критерий χ²=3,92 для вида B. longum; χ²=4,27 для вида B. catenulatum, p<0,05).

Сравнение представленности видов бифидобактерий между группами показало, что у подростков с ожирением не только наблюдали снижение доли ключевых филотипов, но и среднее количество копий генов различных видов было значительно ниже по сравнению с подростками контрольной группы. Зависимость между частотой встречаемости вида и заболеванием была выявлена для B. longum (p<0,05, U_эмп=131) и B. catenulatum (p<0,05, U_эмп=120,5) (табл. 2).

Таблица 2. Частота встречаемости (в %) и среднее количество копий генов бифидобактерий у подростков с ожирением и в группе контроля по данным метагеномного анализа

Примечание. * — доля филотипов (B. longum, B. catenulatum) ниже в группе подростков с ожирением (p<0,05).

Таким образом, сравнительный анализ представленности разных филотипов бифидобактерий в двух группах подростков показал неравномерность их распределения, с наличием значимых отличий в группе подростков с ожирением.

Видовая детекция бифидофлоры методом ПЦР

По результатам ПЦР-исследования бифидофлора выявлялась у всех подростков группы контроля и 16 (88,9%) подростков с ожирением. Все 5 видов бифидобактерий определяли в исследуемой выборке в различных ассоциативных вариантах. Самыми распространенными видами бифидобактерий в группе контроля и подростков с ожирением были B. longum (75,0%), B. adolescentis (72,5%) и B. catenulatum (67,5%). Существенно реже детектировал вид B. bifidum (37,5%), а вид B. infantis детектировал только у подростков с ожирением (5,5%).

Сравнительный анализ спектра бифидобактерий у подростков группы контроля и подростков с ожирением выявил следующие отличия в видовом составе их бифидофлоры: в кишечном микробиоме контрольной группы более широко были распространены виды B. longum (90,9%) и B. adolescentis (81,8%). В группе подростков с ожирением относительно контрольной группы наблюдали снижение частоты встречаемости B. longum (до 55,5%) и B. adolescentis (61,1%) (табл. 3).

Таблица 3. Частота встречаемости (в %) видов бифидобактерий у подростков с ожирением и в группе контроля по данным ПЦР-детекции

Примечание. *Частота встречаемости B. longum ниже в группе подростков с ожирением (χ²=6,59; p<0,05).

Кроме того, у 2 подростков с ожирением не удалось детектировать ни один вид из пяти исследуемых. Этот результат может свидетельствовать о том, что в этих пробах отсутствует ДНК типируемых видов.

Обсуждение результатов

Несколько терминов используется при описании метагеномных данных микробиома для характеристики микроорганизмов. Филотип (филогенетический тип) — термин, характеризующий некультивируемые микроорганизмы, которые известны только по секвенированной последовательности гена 16S рРНК [20]. Этот термин является нейтральным по рангу, поэтому филотипы могут быть описаны на разных уровнях, таких как вид, класс [21]. Если последовательность гена 16S рРНК определенного филотипа является точной, полной длины и совпадает с последовательностями известного вида с гомологией выше 98,7%, можно уверенно утверждать, что филотип соответствует виду микроорганизма.

Основной единицей таксономического профилирования микробиома является вид. Поскольку результаты метагеномного анализа содержат данные, полученные на основе секвенирования без предварительного культивирования, для их биоинформационного анализа используют другие термины. Операционная таксономическая единица (Operational taxonomic unit, OTU) [22] так же, как и вариант последовательности ампликона (Amplicon sequence variant, ASV), представляет кластер последовательностей, которые определяются их сходством. В исследованиях бактериальных микробиомов OTU определяется как кластер из последовательностей гена 16S рРНК, показывающих сходство последовательностей на 97%, и в некоторых случаях этот кластер может включать последовательности нескольких видов, уровень сходства которых выше 98%, что затрудняет разрешение таксономии. В данном исследовании идентификацию последовательностей проводили на основе ASV, которые определяли путем анализа полиморфных сайтов в ампликонах, учитывая, что они имеют более высокую таксономическую чувствительность, чем OTU, сгруппированные с порогом различий в 3% [23]. Ранее было показано, что анализ ASV вместо OTU оказался эффективным в разрешении мелкомасштабной экологической временной динамики и изменений сообщества в микробиоме человека [24].

Поскольку бифидобактерии рассматриваются в качестве ключевых биологических маркеров здорового кишечника, важно знать их состав на видовом уровне. Различия в составе видов бифидофлоры связывают с воспалительными заболеваниями, аллергией, метаболическими нарушениями и ожирением, показано, что конкретные виды обладают различными иммуномодулирующими свойствами [25, 26].

Однако до сих пор нет окончательного ответа, связано ли снижение количества бифидобактерий, изменение их видового состава и развитие болезни. В обзоре O. Castaner и соавт. [27], посвященном анализу современных данных о связях между профилем микробиоты, ожирением и метаболическими нарушениями, приведены достаточно противоречивые данные, и важный вопрос о том, ассоциируется ли ожирение с большим или меньшим разнообразием микробиоты, по-прежнему остается открытым.

В нашем исследовании, по данным метагеномного секвенирования, установлено наличие значимых отличий в группе подростков с ожирением, у которых была снижена не только максимальная доля актинобактерий до 3,19% по сравнению с 21,8% в контрольной группе, но и относительная представленность бифидобактерий. Мы также выявили зависимость между показателями ИМТ и снижением частоты встречаемости, количеством копий генов для видов B. longum и B. catenulatum в разных группах подростков.

Видоспецифичная ПЦР-детекция является важным инструментом, дополняющим метагеномные данные. Следует отметить, что сравнение метагеномной оценки последовательностей с результатами ПЦР показало высокое сходство по виду B. longum, но также присутствовали и расхождения в относительной представленности некоторых видов, которые могут быть обусловлены различной чувствительностью применяемых методов [28]. В нашем исследовании видоспецифичная ПЦР-детекция пяти видов бифидобактерий подтвердила ассоциацию вида B. longum с ИМТ, а также общее снижение частоты встречаемости значимых для организма видов бифидобактерий, что говорит о дисбиотических изменениях кишечного микробиома в группе подростков с ожирением.

Наличие в составе бифидофлоры такого «младенческого» вида, как B. infantis, также свидетельствует о нарушениях кишечной экосистемы подростков с ожирением, стремящейся сохранить свою стабильность посредством включения в состав микробиоценоза несвойственных взрослому населению видов [29].

Согласно H. An и соавт. [30], F. Bianchi и соавт. [31], штаммы B. longum в экспериментах значительно подавляли прирост массы тела и отложение липидов в печени и жировой ткани и, следовательно, могут быть потенциальными терапевтическими кандидатами для лечения ожирения. Можно предположить, что низкая представленность B. longum у подростков с ожирением непосредственно связана с наличием заболевания и является маркером дисбиотических нарушений. Кроме того, проводимые нами исследования подтверждают отмечаемое в ряде работ сокращение микробного разнообразия кишечного микробиома при ожирении [14, 32].

Таким образом, у подростков с ожирением по сравнению с группой контроля при молекулярно-генетическом анализе показано нарушение качественного и количественного состава бифидофлоры, особенно ассоциированное с видом B. longum. Знание видового состава бифидофлоры необходимо как для составления пребиотических и пробиотических добавок в рационе для коррекции микробиоценоза кишечника, так и в качестве индикатора здоровья детей с ожирением.

Информация об исследованиях, где в качестве объектов выступали люди

При включении пациентов в исследование соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki, 1964, 2000). Исследование одобрено комитетом по биомедицинской этике ФГБНУ «НЦ ПЗСРЧ» (протокол №6 от 21.12.15) и выполнено с информированного согласия пациентов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.