Введение
В 2001 г. группа ученых Питсбургского университета под руководством Билла Футрелла [1] обнаружила в жировой ткани присутствие мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, что позволило с научной точки зрения объяснить наблюдаемые пластическими хирургами регенераторные эффекты липофилинга и дало начало новой эре в изучении и клиническом применении жировой ткани.
Вместе с тем оказалось, что кроме мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в жировой ткани содержатся различные субпопуляции клеток, принимающие участие в процессах регенерации: эндотелиальные клетки и их предшественники, гладкомышечные клетки, преадипоциты, перициты, фибробласты, тучные клетки, лейкоциты, эритроциты и другие [2]. Этот клеточный пул, получивший название стромально-васкулярная фракция (далее — СВФ, в зарубежной литературе используется термин Adipose Derived Regenerative Cells — ADRCs), является совокупностью всех ядросодержащих клеток жировой ткани, за исключением зрелых адипоцитов.
Научные исследования показали, что стромальные клетки жировой ткани при трансплантации как в составе липографта, так и в виде клеточного продукта реализуют универсальные регенераторные эффекты: неоангиогенез, стимуляцию раневого заживления, дифференцировку в клетки мезенхимального происхождения, модуляцию иммунного и воспалительного ответов, антисептическое действие. В результате жировая ткань и продукты на ее основе, содержащие СВФ, стали рассматриваться как наиболее удобный инструмент регенеративной хирургии.
Разнообразие методов получения продуктов данной группы привело к широкой вариативности их биологических и физических свойств. В настоящем обзоре мы представляем описание существующих систем выделения СВФ из липоаспирата, а также пути поиска оптимального унифицированного подхода, позволяющего получать качественный биоматериал со стандартными характеристиками.
Классификация методов выделения стромально-васкулярной фракции жировой ткани
Впервые СВФ была выделена из липоаспирата при помощи фермента коллагеназы, расщепляющего адипоциты и соединительнотканные волокна внеклеточного матрикса, что позволило получить чистую клеточную суспензию. Однако трудоемкость и затратность ферментативного метода привели к поиску более простого, механического, способа эмульсификации и дезагрегации жировой ткани. В настоящее время основными способами выделения СВФ являются ферментативный и механический. Каждый из этих методов, в свою очередь, может быть лабораторным, полуавтоматическим и автоматическим [3]. Также активно разрабатываются методы ультразвукового извлечения СВФ [4].
Ферментативный метод
Лабораторный протокол ферментативного получения СВФ состоит из нескольких этапов и заключается в очищении биоматериала от примесей крови, инкубации жировой ткани с раствором коллагеназы, удалении тканевого детрита за счет промывки и фильтрации (рисунок). В результате получается чистая клеточная суспензия, концентрацию клеток в которой можно регулировать за счет разведения в заданном объеме раствора. Такая технология требует специально оборудованной лаборатории, а также специалиста, имеющего необходимую квалификацию. При клиническом использовании дополнительные сложности представляет организация логистики биоматериала между лабораторией и операционной с соблюдением стерильности, холодовой цепи и правильной маркировки.
Рис. Схема ферментативного выделения стромально-васкулярной фракции из липоаспирата.
С целью упрощения процесса ферментативного выделения были разработаны автоматические и полуавтоматические системы, позволяющие получать СВФ не выходя из операционной. Одним из первых подобных медицинских изделий стал аппарат Celution® 800/CRS, производимый компанией Cytori Therapeutics, Inc., США. Однако стоит отметить, что ферментативные методы выделения СВФ характеризуются целым рядом недостатков:
— длительная предварительная подготовка жировой фракции;
— сравнительно долгое время выделения — от 50 мин;
— дороговизна расходных компонентов;
— необходимость наличия специализированной лаборатории или дорогостоящего автоматического устройства;
— риск аллергических реакций на остаточный фермент при недостаточной промывке.
Несмотря на указанные недостатки, концентрация жизнеспособных ядросодержащих клеток СВФ при ферментативном методе существенно превышает таковую в сравнении с механическим методом [5], СВФ, полученная ферментативным методом, не содержит примесей, что позволяет использовать этот биоматериал даже для внутривенного введения.
Механический метод
С начала зарождения липофилинга использовались различные варианты механической обработки жирового трансплантата. Наиболее распространенные из них на сегодняшний день: седиментация, центрифугирование и фильтрация. Задачей каждого метода является получение биоматериала различной степени плотности, что влияет на поведение липографта после трансплантации [6]. Было замечено, что на физические и биологические свойства жирового трансплантата влияет дисперсность и степень сохранности тканевой структуры (прежде всего адипоцитов и внеклеточного матрикса). По мере уменьшения диаметра отдельных фрагментов жира в биоматериале снижаются и его объемообразующие свойства, хотя регенераторный потенциал остается сопоставимым за счет сохранности более устойчивых к механическому повреждению стромальных клеток [6, 7].
Крайней степенью механического разрушения жировой ткани, позволявшей сохранить жизнеспособные стромальные клетки, стала эмульгация. В 2013 г. P. Tonnard и соавт. впервые описали характеристики биоматериала, полученного при эмульгации с помощью переходника с диаметром канала 1,2 мм между двумя 10-миллилитровыми шприцами, который был назван нанофэт (nanofat) и, по сути, явился аналогом СВФ [8]. В нем практически полностью отсутствовали неповрежденные адипоциты, при этом сохранялись жизнеспособные стромальные клетки, а жидкая гомогенная консистенция позволяла вводить конечный продукт через тонкие иглы (27G). Нанофэт в отличие от объемообразующих продуктов на основе липоаспирата (миллифэта, микрофэта) применялся для улучшения качества кожи в деликатных анатомических зонах: периорбитальной и межбровной областях, зоне декольте [8].
В 2015 г. была описана специализированная механическая система для выделения СВФ LipiVage [4], которая принципиально не отличалась от предложенной P. Tonnard, кроме значительно более медленного проведения жира через коннектор (со скоростями порядка 1—2 мл/с).
В течение последних лет методы механической обработки жировой ткани активно развивались, и одним из главных критериев эффективности разрабатываемых устройств стало количество получаемых жизнеспособных ядросодержащих клеток. Так, в 2016 г. была представлена система Lipogems на основе встряхивания липоаспирата, внутри которого находятся металлические шарики [9], однако в публикациях было мало информации о жизнеспособности получаемых клеток [10].
Другими вариантами обработки жировой ткани, в том числе с целью получения СВФ, стало создание сеточных конструкций [11—13], через которые пропускается липоаспират. В качестве примера можно привести медицинские изделия Lipocube [11] и Adinizer [12], отличающиеся друг от друга тем, что Adinizer имеет набор размерных сеток с отверстиями от 4 мм до 100 мкм с острыми краями.
Таким образом, анализируя технологический путь развития методов механического извлечения СВФ, можно предположить, что его дальнейшие перспективы будут связаны с разработкой систем измельчения жировой ткани, нацеленных на увеличение числа жизнеспособных клеток, что, в свою очередь, потребует проведения исследований, посвященных оценке механических свойств жировой ткани в динамике при выполнении процесса обработки. Также перспективной является разработка систем мультикомпонентной обработки, способных обеспечить эффективное получение разделенных между собой типов жировой ткани: миллижира, микрожира и наножира.
В отличие от ферментативного получения СВФ механический метод, основанный на повреждении стромально-сосудистого матрикса с помощью механического воздействия с разрушением зрелых адипоцитов, не требует добавления дорогостоящих специальных ферментативных растворов с необходимостью их последующей деактивации. При таком подходе извлеченный липоаспират подвергается многократной механической обработке, после чего центрифугируется, далее производится забор осадка, содержащего стромальные клетки. При этом содержание жизнеспособных ядросодержащих клеток будет меньше, чем при использовании ферментативного метода. В целом механические методы получения СВФ характеризуются как достоинствами:
— минимальная предварительная подготовка;
— минимальное время выделения СВФ (порядка 10 мин);
— относительная дешевизна расходных компонентов;
— относительная простота технологии для выделения СВФ,
так и недостатками:
— более низкая жизнеспособность СВФ (до 70% при более 90% с использованием фермента);
— конечный продукт содержит большее количество примесей тканевого детрита.
Метод непосредственного получения СВФ из исходного образца жира сложно описать единой последовательностью действий. Можно выделить два подхода:
— использование коннекторов для механической обработки жировой ткани между двумя шприцами, такой способ допустимо назвать «капиллярным»;
— применение специальных сеток-сепараторов, находящихся внутри коннектора, соединяющего между собой два шприца, для такого способа целесообразно использовать термин «мембранно-ячеистый».
При капиллярной механической обработке допустимыми является предварительное удаление волокон соединительной ткани с помощью пинцета из забранного образца жира [14]. Далее осуществляется непосредственно капиллярная обработка: между двумя шприцами объемом 10 мл или 20 мл устанавливается специальный капиллярный коннектор диаметром 2,4 мм [11, 14] или диаметром 1,2 мм [11, 15, 16], далее со скоростью примерно 10 мл/с осуществляется порядка 30 перегонов [8, 11, 14—16] жира из одного шприца в другой.
В работе [17] рассматривается зависимость концентрации клеток от числа перегонов. Исходный липоаспират предварительно центрифугировался в течение 5 мин с ускорением 680 g, затем очищенную от масляной и водянистой фракции жировую ткань помещали в 10-миллиметровый шприц, который подсоединялся к стопорному трехходовому крану BD Connecta. После жировая ткань эмульгировалась за счет 20, 30 и 40 перегонов между шприцами. Авторы делают вывод, что наиболее приемлемым является 20-кратный перегон между шприцами.
После механической обработки возможна дополнительная фильтрация [8] через сетку с диаметром отверстий 500 мкм [14]. Выделение СВФ завершается финальным центрифугированием в течение 3 мин с ускорением 2000 g [14].
Стоит отметить, что отдельным вопросом являлась оценка скорости перегона липоаспирата между шприцами. Во многих работах, ссылаясь на публикацию [8], авторы использовали коннекторы Luer-Lock диаметром 1,2 мм, 1,4 мм и 2,4 мм и проводили 30-кратное эмульгирование со скоростью 20 мл/с [16, 18—20]. Другие исследователи [18, 21, 22], изменяя скорость и число прогонов липоаспирата, количественно оценивали время процедуры без указания точного числа перегонов. Одним из вариантов используемых параметров процедуры эмульгирования была скорость перегонов 10 мл/с и время процедуры 0,5 мин и в диапазоне 1—5 мин с шагом 1 мин. В исследовании [23] авторы применяли классический коннектор Luer-Lock 1,4 мм, а перемешивание проводилось 30 раз на максимально возможной скорости. Для исследования влияния размера коннектора было проведено сравнение типоразмеров 0,8 мм, 1 мм, 1,2 мм, 2 мм и 3,76 мм [24]. В качестве коннекторов использовали как стандартные муфты и трехходовые переходники Luer-Lock, так и специализированные преобразователи жировой ткани производства Xialong Medical Equipment.
Проанализировав опыт коллег, можно сделать вывод, что при выборе капиллярного коннектора предпочтительным является устройство диаметром не менее 1 мм с минимальным числом перегонов липоаспирата. Вопрос о выборе скорости перемещения липоаспирата остается открытым ввиду недостаточности исследований и консервативного подхода к ее оценке.
Использование мембранно-ячеистых эмульгаторов предполагает применение коннекторов с сеточными проходными отверстиями для получения СВФ. Данные системы, как правило, представлены специализированными для выделения СВФ медицинскими изделиями.
Одной из таких систем является оригинальная коммерческая система LipoCube [11]. Для единичного перегона жира и разрушения крупных частиц жировой ткани производитель рекомендует использовать самую большую сетку, затем последовательно применяются сетки меньшего размера и количество перемешиваний 10 и 3—4 соответственно. В открытых источниках отсутствует информация о размерах используемых сеток.
Специализированная модификация системы для получения СВФ Lipocube SVF отличается увеличенным до пяти количеством сеток. Был изучен процесс микронизации жира с размерами трех из пяти сеток: 1 мм, 0,75 мм и 0,5 мм. Количество перемещений через сетки соответственно равно 10, 10, 3, 10, 3 — от крупной до самой мелкой [25].
Поскольку в организме человека жировая ткань является одной из самых чувствительных к механическому воздействию, рекомендуется оптимально дозировать силу давления на нее [12, 26]. На рынке представлена система, состоящая из режущей сетки, — адинайзер. Авторы ввели новый термин — «адинирование», который означает разрезание биоматериала сверхострыми лезвиями для доведения фрагментов жировой ткани до желаемого размера и отделения стромальных клеток от паренхиматозных клеток и внеклеточного каркаса.
В состав системы может входить целый набор сеток размерами 100 мкм, 200 мкм, 400 мкм, 600 мкм, 1200 мкм, 2400 мкм и 4000 мкм. Рекомендованная скорость эмульгирования, позволяющая минимизировать негативные эффекты давления на жировую ткань, составляет 10 мл/с [12].
Особый интерес представляет исследование [27], в котором авторы разработали систему, состоящую из механизмов эмульсификации, микронизации и фильтрации. Ее особенность — использование автоматической шприцевой помпы для перегонки липоаспирата через устройство эмульсификации со скоростью 20 мл/с и с числом перегонов 20—30 раз. Далее полученный СВФ-гель фильтруют с помощью специально изготовленной нейлоновой сетки с размерами ячеек 0,5 мм и 1 мм для удаления крупных фрагментов жировой ткани. Структурные особенности устройства эмульсификации и микронизации авторы подробно не приводят. Эту систему отличают значимые относительные концентрации и общее число эндотелиальных клеток-предшественников и мезенхимальных стволовых клеток.
На основе проведенного анализа структурно-функциональных особенностей мембранно-ячеистых коннекторов их можно разделить на коннекторы, имеющие гладкие края (например, Lipocube), основное назначение которых — фильтрация внеклеточного матрикса, и коннекторы, обладающие острыми краями (Adinizer), позволяющие удалять крупные адипоциты и потенциально повышать выживаемость ядросодержащих стромальных клеток. Характерные размеры ячеек рассматриваемых «гладкостеночных» сеток должны быть не менее 0,5 мм, а сеток с острыми краями — не менее 0,1 мм. Также важно учитывать, что технология получения СВФ на основе мембранно-ячеистых коннекторов имеет тенденцию к уменьшению числа перемешиваний липоаспирата.
Также можно предположить, что «идеальная» система получения биоматериала с заданными параметрами должна состоять из трех последовательно связанных технических звеньев: капиллярного коннектора, «гладкостеночного» сетчатого фильтра и мембранно-ячеистого коннектора с острыми краями. В такой системе критическими параметрами являются:
— минимальный диаметр капилляра 0,5 мм;
— минимальный диаметр отверстий сетчатого фильтра 0,2 мм;
— число перемешиваний через сетчатый фильтр и мембранно-ячеистую сетку 0,3 мм должно быть минимально возможным;
— выживаемость клеток СВФ после применения всех звеньев системы должна составлять не менее 90%.
Сейчас на мировом рынке присутствуют разнообразные системы механического выделения СВФ, которые используют различные технические решения для эффективного извлечения СВФ из жировой ткани пациентов (например, Revolve (LifeCell Corporation, США), StromaCell, LipiVage).
Параметры, влияющие на эффективность механических методов выделения стромально-васкулярной фракции
Несмотря на разнообразие подходов к механической обработке липоаспирата, в настоящее время продолжается поиск оптимальной конструкции устройства, способной обеспечить максимальный выход жизнеспособных стромальных клеток с минимальными материальными и временными затратами. Для разработки подобного устройства необходимо понимание, каким образом физические силы при различных методах процессинга влияют на свойства жировой ткани.
Оценка качества конечного продукта после механической обработки липоаспирата проводится путем: описания морфологии (гистология, цитология) [26, 28], оценки качественного и количественного клеточного состава (проточная цитометрия) [13, 28, 29], определения жизнеспособности ядросодержащих клеток [30—33]. Характеристики полученной СВФ напрямую зависят от параметров механического воздействия.
Давление, перемешивание и создаваемое при этом напряжение сдвига являются основными параметрами воздействия, влияющими на механическое разрушение жировой ткани и выделение СВФ. Они определяются параметрами системы механического получения СВФ, а именно: объемной скоростью переноса жировой ткани через коннектор, количеством переносов, усилием, прилагаемым, для переноса жировой ткани. Значимыми являются геометрические параметры эмульгатора жировой ткани, а также биомеханические параметры жировой ткани, в частности кинематическая вязкость.
В нашем собственном исследовании мы предприняли попытку определения взаимосвязей между параметрами системы для механического получения СВФ, параметрами жировой ткани и параметрами необходимого механического воздействия на нее.
Механические параметры жировой ткани применительно к задаче получения СВФ рассматриваются в двух работах [18, 34]. В обоих случаях при описании эмульгирования жировой ткани ограничивались указанием объемов шприцов и диаметров переходника между ними. В первом исследовании использовали два 10-миллиметровых шприца и коннектор Luer-Lock с внутренним диаметром отверстия 2,4 мм [18]. Создаваемый надавливанием поток оценивался (визуально, без использования каких-либо специализированных средств) в 10 мл/с при длительности эмульгирования 1 мин. В другой работе [34] применялись 10-миллилитровые шприцы и совершалось 30 переносов липоаспирата из шприца в шприц с объемной скоростью около 20 мл/с. Кинематическая вязкость измерялась до и после механического воздействия для СВФ и для контрольного образца. Использовались вискозиметры Brookfield #2 (Middleboro, MA) и DV-I Prime (Brookfield Engineering Laboratories). Рассчитанные значения числа Рейнольдса для всех образцов варьировали в диапазоне от 18,9 до 143. Был сделан вывод о том, что при любых условиях поток будет ламинарным. Значения измеренной вязкости и рассчитанного напряжения сдвига приведены в табл. 1.
Таблица 1. Кинематическая вязкость и напряжение сдвига в контрольном образце и в стромально-васкулярной фракции
| Автор | ν (контрольный образец), сСт | ν (СВФ), сСт | Напряжение сдвига (контрольный образец), дин/см2 | Напряжение сдвига (СВФ), дин/см2 |
| Y. Ye и совт. [18] | 140 | 40,3 | 10 336 | 2971 |
| D.A. Banyard и соавт. [34] | 86,9 | 45,5 | 3326 | 1818 |
Значительные различия в параметрах вязкости и напряжения сдвига в контрольных образцах связаны с различными методами их предобработки и обусловлены различными параметрами механического воздействия, что подтверждает необходимость исследования их влияния на свойства получаемой СВФ.
Для выбора оптимального метода извлечения СВФ нами проведена сравнительная оценка вариантов технических решений для выделения СВФ из жировой ткани, которая позволяет рассмотреть преимущества и ограничения каждого метода. Основные параметры рассматриваемых методов приведены в табл. 2.
Таблица 2. Сравнение методов выделения стромально-васкулярной фракции
| Метод выделения | Характеристика | |||
| особенности | преимущества | недостатки | устройство | |
| Фильтрация | Основным принципом работы является использование специальных фильтров, которые позволяют задерживать крупные частицы жировой ткани и пропускать СВФ | Высокое качество выделения из-за применения фильтров определенного размера. Полученная фракция СВФ освобождается от примесей и других компонентов жировой ткани | Возможное засорение фильтра, вызывающее потерю некоторого количества клеток СВФ | Revolve |
| Центрифугирование | Основано на применении центробежной силы, которая приводит к разделению компонентов жировой ткани в зависимости от их плотности | Высокая эффективность выделения СВФ. Быстрое отделение СВФ от других компонентов жировой ткани. Возможность получения высокого выхода СВФ | Требуются специальные емкости или пробирки для проведения центрифугирования. Существует риск потери клеток СВФ при неправильной настройке режима работы центрифуги | StromaCell |
| Комбинированные методы | Сочетание нескольких методов выделения в одном устройстве позволяет повысить эффективность получения СВФ | Комбинация различных технических подходов позволяет достичь высокой эффективности выделения СВФ. Обеспечивает более полную очистку СВФ от примесей, загрязнений и других нежелательных компонентов жировой ткани. Более эффективное разрушение жировых клеток и выделение СВФ за счет комбинации нескольких методов | Использование данных методов может требовать дополнительных этапов обработки, что может привести к увеличению общего времени процесса. Повышенные требования к проектированию устройств для оптимального сочетания нескольких методов | LipiVage, Lipocube |
Таким образом, предпочтительными являются комбинированные методы, поскольку эффективность систем, разработанных на их основе, сравнима с эффективностью более сложного и длительного ферментативного метода (табл. 3).
Таблица 3. Сравнение эффективности методов выделения стромально-васкулярной фракции
| Метод выделения СВФ | Количество жизнеспособных клеток на мл | Жизнеспособность клеток |
| Механический | 0,94·106 | 97,55% |
| Ферментативный | 1,74·106 | 96,67% |
Кроме того, у клеток, полученных ферментативным способом, отмечается более высокий уровень пролиферативной активности.
Преимущества комбинированных систем механического получения СВФ определяются следующими особенностями.
1. Улучшенная эффективность: комбинирование различных методов позволяет достичь более эффективного выделения СВФ по сравнению с использованием одного метода. Каждый метод вносит свой вклад в процесс разрушения жировых клеток и извлечения СВФ, что увеличивает общий выход и повышает качество полученной фракции.
2. Удаление примесей и загрязнений: дополнительные этапы, такие как фильтрация, эмульсификация или промывка, позволяют удалить нежелательные примеси и загрязнения из жировой ткани.
3. Бóльшая гибкость и адаптивность: комбинированные системы обеспечивают бóльшую гибкость и возможность настройки в зависимости от конкретных требований и особенностей жировой ткани. Они позволяют выбирать оптимальные параметры разрушения жировых клеток, фильтрации или других этапов процесса в соответствии с целями процедуры и особенностями пациента.
В связи с перечисленными преимуществами комбинированные методы становятся более предпочтительными для систем механического выделения СВФ. Они предлагают более полный и оптимизированный процесс выделения СВФ с учетом различных аспектов разрушения жировых клеток, фильтрации, очистки и обработки.
Заключение
Стромальные клетки являются основным драйвером регенераторных эффектов жировой ткани. Стромально-васкулярная фракция и ее аналог — эмульгированный жировой трансплантат (nanofat) являются основными инструментами современной регенеративной хирургии. Исследования в данной области привели к появлению разнообразных методов получения этих биоматериалов, а также к разработке большого количества коммерческих систем. Ввиду существенной разницы в свойствах конечного продукта (таких как концентрация и жизнеспособность стромальных клеток, наличие примесей), удобстве клинического применения, регуляторных ограничениях и стоимости технологического процесса при использовании различных устройств продолжается поиск оптимального подхода к выделению стромально-васкулярной фракции. Наиболее перспективными являются разработки механической системы обработки жировой ткани, которая должна не только обладать оптимальным сочетанием методов воздействия, позволяющим эффективно разрушать жировую ткань при сохранении жизнеспособности стромальных клеток, но и иметь стандартизованные автоматизированные условия приложения физических сил.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.