В настоящее время курение стало одной из главных проблем здравоохранения как важный фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), в том числе атеросклероза [1-4]. Курение способствует образованию бляшек, повышает размер повреждений и их количество [5-7]. На развитие атеросклероза сигаретный дым влияет через множество клеточных процессов, таких как воспаление, миграция и пролиферация клеток [7, 8].

Входящие в состав сигаретного дыма многочисленные канцерогены являются причиной как мутагенных, так и эпигенетических изменений в геноме курильщиков [9, 10]. К последним относится метилирование цитозин-(фосфат)-гуанин (CpG) динуклеотидов [2, 10, 11]. Многочисленные исследования [12-14] показали достоверную связь курения как с гиперметилированием промоторной области генов, так и с глобальным гипометилированием.

Благодаря исследованиям ассоциаций эпигенома (EWAS - Epigenome-wide Association Studies) уже выявлено большое количество CpG сайтов (CpG) в различных генах, метилирование которых связано с курением [15-27]. Все они вовлечены в разнообразные клеточные процессы, например AHRR и CYP1A1 участвуют в сигнальном пути арил-углеводородного рецептора, который является посредником детоксикации компонентов табачного дыма, а GFI1 задействован в разных процессах развития [28]. В то же время для российской популяции данный вопрос мало изучен.

Цель настоящего исследования - поиск ассоциаций между курением и уровнем метилирования генома в российской популяции.

Объект исследования. В исследование включали пациентов с описанным статусом курения из когорты исследования АТЕРОГЕН-ИВАНОВО ("Изучение особенностей развития и прогрессирования АТЕРОсклероза различной локализации, в том числе с учетом ГЕНетических и эпигенетических факторов сердечно-сосудистого риска - субисследование ЭССЕ-ИВАНОВО") [29] и когорты исследования ЭПИКУР ("Исследование ЭПИгенетических маркеров связанных с КУРением и развитием атеросклероза"). Всего включены 162 пациента: 60 курящих и 102 - некурящих.

Изучение уровня метилирования с помощью микрочипов. ДНК для исследования получали из венозной крови с помощью QIAamp DNA Blood Mini Kit ("Qiagen", США) в соответствии с протоколом. Для каждого образца использовали 5 мкг ДНК, соникированной на Covaris S220 ("Covaris", США). Концентрацию измеряли на Implen Nanophotometer (Implen, Германия). Для иммунопреципитации применяли Dynabeads Pan Mouse IgG ("Invitrogen", Нидерланды) и Anti-5-Methylcytidine Monoclonal Antibody ("Eurogentec", Нидерланды). Подготовка образцов, мечение, обработка микрочипов Human DNA Methylation Microarrays 1 × 244K ("Agilent", США) и сканирование на сканере Innopsys InnoScan 900 ("Innopsys", США) выполняли согласно последней версии протокола компании "Agilent" (v2.2, 2014).

Статистический анализ. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программы Statistica 6.0. Как статистически достоверное принимали значение p<0,05. На начальном этапе статистического анализа проводили проверку исследуемых количественных признаков на нормальность распределения. За нормальное распределение принимали то распределение, для которого p-значение критерия Шапиро-Уилка составляло более 0,05. Учитывая несоответствие нормальному распределению ряда сравниваемых признаков, данные представлены в виде: медиана [25; 75 процентили].

Данные с микрочипов были получены с помощью программного обеспечения Agilent Feature Extraction (v.12.0.0.7, "Agilent", США). Анализ исходных данных выполняли с помощью пакетов в программной среде R: внутричиповая нормализация - с помощью пакета R "affy" (функция "normalize.loess"), межчиповая нормализация - с помощью пакета R "preprocessCore" (функция "normalize.quantiles"). Общее количество CpG после удаления CpG с X и Y хромосом составило 235336. Множественное сравнение было проведено с помощью пакета R "p.adjust" методом "fdr". Этот метод корректирует значение p в зависимости от количества сравнений. Поэтому при анализе выборок с разным числом сравнений (все CpG с ДНК-микрочипа или CpG в генах EWAS) поправка на множественные сравнения будет отличаться. Статистически значимые различия принимались при скорректированном значении p (p.adj) менее 0,05.

Для уменьшения размерности набора данных, извлечения наиболее значимой информации и визуализации при анализе использовали метод главных компонент (Principal component analysis, PCA). Анализ главных компонент проводили с помощью функции "prcomp", реализованной в пакете "stats" языка программирования R.

Результаты исследования графически представлены в виде "манхеттенского графика" (Мanhattan plot). На графике по вертикальной оси отложены значения отрицательного логарифма по основанию 10 от значений p, а по горизонтальной - хромосомы с геномными локусами на них. График построен с помощью пакета R "qqman" (функция "manhattan").

Клиническая характеристика пациентов. После применения метода главных компонент данные 15 пациентов были исключены из анализа. В результате общее число пациентов стало 147 (54 - курящие, 93 - некурящие), из них 99 мужчин и 48 женщин. Медиана возраста составила 48 лет [37, 58].

Эпигенетический анализ. Исследование влияния курения на уровень метилирования ДНК проходило в два этапа. В первую очередь нам предстояло выявить все CpG, метилирование которых ассоциировано с курением. Так, при сравнении двух групп (курящие и некурящие) из 235 336 CpG с p<0,05 было получено 19 645 дифференциально метилированных. После поправки на множественные сравнения остался только один CpG в гене SIX1 (chr14:61114710-61114754) (p=9,39E-08, p.adj=0,0221) (рис. 1

По данным литературы, метилирование гена SIX1 ранее не было связано с курением. В то же время достоверных различий в уровне метилирования генов, ранее ассоциированных с курением, получено не было. Поэтому второй задачей исследования стало проведение дополнительного статистического анализа только для этих генов. Это позволило увеличить пороговое значение p, при котором, при введении поправки на множественные сравнения, p.adj становится меньше 0,05 в связи с уменьшением числа сравнений. Из 141 ранее выявленных генов EWAS на ДНК-микрочипах Agilent, исходя из дизайна, есть возможность определять уровень метилирования только 119, которым принадлежало 2108 локусов. В итоге различия с уровнем значимости p<0,05 были выявлены для 167 дифференциально метилированных CpG, однако поправку на множественные сравнения прошли только два - ABTB1 (chr3:127391764-127391808) - p=3,23E-05, p.adj=0,0458, NAV2 (chr11:19586240-19586284) - p=4,50E-05, p.adj = 0,0458) (рис. 2

В результате нашего исследования при сравнении уровня метилирования геномов курящих с таковыми у некурящих достоверные различия были выявлены для CpG в гене SIX1 (SIX homeobox 1). Он кодирует белок, являющийся гомеобокс белком, который подобен продукту гена sine oculis дрозофилы. Этот ген находится в кластере родственных генов на хромосоме 14 и, как полагают, участвует в развитии конечностей. Дефекты в этом гене являются причиной аутосомно-доминантной глухоты типа 23 (DFNA23) и отобранхиального синдрома (ОБ) типа 3 (BOS3) [30]. Ранее о связи метилирования этого гена с курением не сообщалось.

Однако при сравнении тех же групп курящих и некурящих лиц только по генам EWAS достоверная связь была выявлена для CpG в двух генах. Один из них, ABTB1 - ankyrin repeat and BTB (POZ) domain containing 1, - кодирует белок с областью анкириновых повторов и двумя доменами BTB/POZ, которые, как считают, участвуют в белок-белковых взаимодействиях. Экспрессия этого гена активируется фосфатазой и гомологом ангиотензина, который является опухолевым супрессором. Альтернативный сплайсинг приводит к трем вариантам транскрипта [31]. Впервые связь метилирования этого гена с курением показали в работе Y. Sun и соавт. [18].

Второй ген, NAV2 (neuron navigator 2), возможно, играет роль в клеточном росте и миграции. Для него были выявлены несколько вариантов транскриптов, кодирующих различные изоформы [32]. Связь метилирования этого гена с курением ранее была показана в работе S. Zeilinger и соавт. [19].

В нашей работе впервые показана достоверная ассоциация степени метилирования CpG в гене SIX1 с курением. При дополнительном анализе уровня метилирования 119 генов, ранее ассоциированных с курением в исследованиях EWAS, связь уровня метилирования с курением была показана для генов ABTB1 и NAV2.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования - А.М, А.Е., Д.Ч., С.Б.

Сбор и обработка материала - А.М., Д.Ч., П.Ш., К.Т., Р.М., С.Е., А.К.

Статистическая обработка - Э.Х.

Написание текста - А.М., А.К.

Редактирование - Д.Ч., С.Б.