Введение
Многие актуальные вопросы, касающиеся продуктивной рецепторной взаимосвязи эмбриона и бластоцисты у пациенток с бесплодием и доброкачественными заболеваниями матки, необходимой для удачной имплантации, остаются без ответа. В успешной имплантации эмбриона участвует широкий спектр молекул для передачи сигналов как между клетками, так и внутри них. Активное межклеточное взаимодействие осуществляется благодаря нескольким семействам цитокинов. Связывание лиганда с соответствующим рецептором клетки-мишени вызывает специфический ответ, который может являться ключевым фактором для успешного наступления и протекания беременности. Дисбаланс в регуляции активности иммунокомпетентных клеток при различных морфологических изменениях эндо- и миометрия, а также увеличение продукции ими цитокинов служат одной из причин несостоявшейся имплантации или нарушения развития эмбриона с последующим прерыванием беременности, как правило, в ранние сроки [1, 2].
В раннем периимплантационном периоде нормальная экспрессия генов сигнального пути TP53 отвечает за возможность внедрения бластоцисты в эндометрий [3]. Известно, что ген TP53 является регулятором качества и созревания ооцитов. При этом супрессор опухоли p53 (продукт гена TP53) имеет решающее значение для имплантации эмбриона за счет активации транскрипции LIF — фактора ингибирования лейкозных клеток [4]. Одним из основных регуляторов функции p53 является белок MDM2, а множественные формы клеточного стресса активируют p53 путем ингибирования MDM2-опосредованной деградации p53. Как ближайший аналог MDM2 был идентифицирован ген MDM4 (также MDMX), наиболее известный ингибитор p53 [5, 6].
Особое внимание в нашем исследовании уделено цитокину, регулирующему фазу оппозиции и адгезии бластоцисты и являющемуся представителем семейства IL-6 — фактору, ингибирующему лейкемию (LIF). LIF принадлежит семейству цитокинов, включающему онкостатин-M, интерлейкин-6, интерлейкин-11, цилиарный нейротрофический фактор и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Эти факторы считаются родственными на основании гомологии последовательности, локализации генов на хромосоме и структуре их рецепторов. Точный эффект LIF в развитии трофобласта недостаточно понятен, однако установлено, что LIF является промежуточным звеном в процессе имплантации. LIF представляет собой гликопротеин железистого эпителия, который необходим для децидуализации эндометрия; есть данные, подтверждающие его опосредованное действие в сигнальном пути, регулирующем целостность клеточных контактов, пролиферацию и дифференцировку клеток стромы [7—9]. При недостаточной продукции LIF бластоциста не способна к имплантации. В эндометрии фертильных женщин гены сигнального пути TP53 экспрессируются в течение всего менструального цикла, а пик экспрессии приходится на «окно имплантации». Известно, что уровень экспрессии эстрогенчувствительного цитокина LIF снижается в эндометрии женщин с бесплодием [10—13].
Цель исследования — определение однонуклеотидных полиморфизмов генов сигнального пути TP53: LIF rs41281637, LIF rs929271, MDM2 rs2279744; MDM4 rs1563828, TP53 rs1042522 у пациенток с первичным и вторичным бесплодием и доброкачественными процессами в эндометрии.
Материал и методы
В исследование включены 53 пациентки репродуктивного возраста от 22 до 48 лет (средний возраст 34,8±4,2 года) с жалобами на отсутствие беременности при регулярной половой жизни без контрацепции и с наличием различных доброкачественных заболеваний эндометрия (полипы, гиперплазия эндометрия, внутриматочные синехии и хронический эндометрит) и 18 пациенток с доброкачественными заболеваниями эндометрия, не планирующие беременность на момент обращения. Пациентки соответствовали следующим критериям включения: возраст от 18 до 49 лет; отсутствие беременности в течение года до момента обращения и наличие патологии эндометрия в момент обращения. В соответствии с целью нашей работы все пациентки на основании жалоб были разделены на nhb-группы. В 1-ю группу были включены 33 пациентки с первичным бесплодием в возрасте от 26 до 42 лет (средний возраст 33,4 года); 2-ю группу составили 20 пациенток в возрасте от 22 до 48 лет (средний возраст 36 лет) с вторичным бесплодием. В 3-ю группу вошли 18 женщин в возрасте от 27 до 45 лет (средний возраст 35,5 года) с наличием доброкачественных заболеваний эндометрия и не предъявлявших жалоб на отсутствие беременности, т.е. не планировавших беременность. Необходимо отметить, что у отдельных пациенток имелись беременности в прошлом, у некоторых пациенток беременностей не было, так как вопрос деторождения для них был неактуальным на момент обращения. Пациенток этой группы с сохранной детородной функцией мы расценивали как контрольную группу по отношению к пациенткам с бесплодием.
При анализе данных анамнеза и осмотра пациенток мы пришли к выводу, что возраст и антропометрические данные пациенток в обследуемых группах подчинялись закону нормального распределения (p>0,05) на основании критерия Колмогорова—Смирнова, но, учитывая небольшой объем выборки для каждой из групп, мы применяли здесь и далее непараметрические методы расчета (табл. 1).
Таблица 1. Клинико-анамнестическая характеристика обследованных пациенток
| Показатель | Группа | ||
| 1-я (первичное бесплодие), n=33 | 2-я (вторичное бесплодие), n=20 | 3-я (контрольная группа), n=18 | |
| Возраст менархе, годы | 13,2±1,5 | 12,7±1,4 | 13,1±1,4 |
| Менструальный цикл, дни | 26—34 | 27—35 | 26—35 |
| Длительность менструации, дни | 4—6 | 3—6 | 4—6 |
| ИМТ до 25 кг/м2, абс. число | 22 | 9 | 15 |
| ИМТ > 25 кг/м2, абс. число | 11 | 11 | 3 |
| Попытки ЭКО в анамнезе, абс. число | 6 | 8 | — |
Тест Манна—Уитни не выявил статистически значимых различий по возрасту, характеру менструальной функции (возраст менархе, длительность менструального цикла, продолжительность менструации). Основным показателем, который продемонстрировал статистически значимое отличие, стал индекс массы тела (ИМТ) >25 кг/м2 — у пациенток со вторичным бесплодием он был выше; кроме того, в контрольной группе не было пациенток с внутриматочными синехиями и хроническим эндометритом.
Перед оперативным лечением всем пациенткам в рамках подготовки к нему проводилось клинико-лабораторное обследование в соответствии с Приказом МЗ от 20.10.20 №1130н «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю «акушерство и гинекология».
Пациентки с жалобами на бесплодие частично были обследованы амбулаторно: исключен мужской фактор бесплодия, оценена проходимость маточных труб, а также исключены эндокринные причины бесплодия, подтверждено наличие овуляции. Для исключения маточного фактора бесплодия на амбулаторном этапе пациенткам 1-й и 2-й групп выполнено ультразвуковое исследование органов малого таза и обнаружена различная патология полости матки (гиперплазия, полипы эндометрия, внутриматочные синехии). При поступлении в отделение (табл. 2) у пациенток 1-й группы предварительным диагнозом был полип и гиперплазия эндометрия, у 2-й группы — полип, гиперплазия эндометрия и внутриматочные синехии. Пациентки 3-й (контрольной) группы обращались с жалобами на нарушение менструального цикла: обильные менструации и межменструальные кровотечения. Предварительным диагнозом в этой группе чаще всего был полип эндометрия (см. табл. 2).
Таблица 2. Доброкачественные заболевания эндометрия у пациенток обследованных групп
| Изучаемая нозология | Группа | ||
| 1-я (первичное бесплодие), n=33 | 2-я (вторичное бесплодие), n=20 | 3-я (контрольная), n=18 | |
| Полип эндометрия | 19 | 6 | 13 |
| Гиперплазия эндометрия | 11 | 4 | 5 |
| Внутриматочные синехии | 2 | 8 | 0 |
| Хронический эндометрит | 1 | 2 | 0 |
В зависимости от выявленной патологии пациенткам проводилось оперативное лечение в следующем объеме: гистероскопия, раздельное диагностическое выскабливание; гистероскопия, лазерная полипэктомия; гистероскопия, деструкция внутриматочных синехий. Пациенткам с внутриматочными синехиями после их деструкции проводилась биопсия эндометрия для гистологического исследования.
Гистологическое исследование тканей. Образцы эндометрия, полученные во время операции, исследовали в лаборатории патоморфологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Ткань эндометрия фиксировали по стандартной методике. Для морфологического исследования с каждого блока проводили не менее 10 ступенчатых срезов. Оценку гиперпластически измененного эндометрия осуществляли в соответствии с классификацией экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ).
Выделение геномной ДНК. В качестве биологического материала для выделения геномной ДНК использовали образцы ткани эндометрия. ДНК была выделена с использованием набора для выделения ДНК из широкого спектра биологических образцов, спин-колонки, diaGene («Диаэм», РФ).
Генотипирование ДНК. Исследование полиморфных маркеров проводили методом секвенирования по Сэнгеру. Дизайн праймеров осуществляли с помощью PrimerBlast (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast/).
Секвенирование. Для реакции секвенирования использовали набор BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, секвенирование проводили на генетическом анализаторе 3500 (Thermo FS).
Для расчета статистической значимости разницы по распространенности патологических изменений использовали точный двусторонний тест Фишера и критерий χ2. Статистический анализ производили с применением программ MC Excel, SPSS Statistics.
Результаты и обсуждение
Пациентки после проведенного вмешательства находились в стационаре 1—2 дня, выписывались в удовлетворительном состоянии для продолжения назначенной терапии в амбулаторных условиях.
Всем пациенткам в послеоперационном периоде назначали комплексную противовоспалительную, ангиопротекторную, антигипоксическую терапию при наличии определенных показаний — антибактериальную и гормональную терапию.
После хирургического лечения мы проанализировали данные гистологического исследования и полиморфизм генов сигнального пути TP53 в каждой группе.
В группе пациенток с первичным бесплодием при гистероскопии был подтвержден диагноз полипа эндометрия (19 наблюдений) и гиперплазии эндометрия (11 наблюдений), у 2 пациенток обнаружены внутриматочные синехии и у одной пациентки — хронический эндометрит. Все интраоперационные диагнозы были подтверждены результатами гистологического исследования. При изучении полиморфизма у всех пациенток обнаружен LIF rs41281637 (G/A), гетерозиготный вариант гена MDM2 rs2279744 выделен у 22 (66%) пациенток, гомозиготный и гетерозиготные варианты гена MDM4 rs1563828 определялись менее чем в 50% наблюдений, гетерозиготный вариант TP53 rs1042522 определен у 19 (57%) пациенток, в то время как у группы пациенток с вторичным бесплодием и в контрольной группе отмечались слабые взаимосвязи или их отсутствие между гомозиготными нуклеотидными полиморфизмами по тем же генам.
Во 2-й группе среди 20 пациенток с вторичным бесплодием у 10 пациенток интраоперационно подтвержден диагноз внутриматочных синехий и хронического эндометрита, у 6 пациенток гистологически подтвердился диагноз полипа эндометрия. При изучении полиморфизма генов у всех пациенток также обнаружен LIF rs41281637 (G/A), гомозиготные варианты (T/T), (G/G) гена LIF rs9292271 (T/G) выделены соответственно у 15 (75%) и 10 (50%) пациенток (см. табл. 3), гомозиготный вариант гена MDM4 rs1563828 определялся в 50% наблюдений.
Таблица 3. Определение полиморфизма генов сигнального пути ТР53 у пациенток обследованных групп, абс. (%)
| Группа | Анализируемый ген | ||||||||||||
| LIF rs41281637 (G/A) | LIF rs9292271 (T/G) | MDM2 rs2279744 (T/G) | MDM4 rs1563828 (A/G) | TP53 rs1042522 (G/C) | |||||||||
| G/G | Т/T | T/G | G/G | Т/T | T/G | G/G | A/A | A/G | G/G | C/C | C/G | G/G | |
| 1-я | 33 (100) | 14 (42) | 9 (27) | 21 (63) | 9 (27) | 22 (66) | 5 (15) | 9 (27) | 11 (33) | 15 (45) | 7 (21) | 19 (57) | 9 (27) |
| 2-я | 20 (100) | 15 (75) | 4 (20) | 10 (50) | 8 (40) | 9 (45) | 3 (15) | 11 (55) | 9 (45) | 1 (5) | 5 (25) | 7 (35) | 8 (40) |
| 3-я | 18 (100) | 7 (39) | 10 (55) | 1 (5) | 11 (61) | 6 (33) | 1 (5) | 7 (38) | 6 (33) | 4 (22) | 1 (5) | 13 (72) | 3 (16) |
Пациентки 3-й (контрольной) группы (18 женщин) поступали с диагнозом: «гиперплазия» или «полип эндометрия», после оперативного лечения эти диагнозы были подтверждены гистологически. При анализе полиморфизма у всех пациенток также обнаружен LIF rs41281637 (G/A), гетерозиготный вариант гена LIF rs9292271 (T/G) выделен у 10 (55%) пациенток, гомозиготный вариант гена MDM2 rs2279744 (T/G) определялся в 61% наблюдений, гетерозиготный вариант гена TP53 rs1042522 (G/C) — в 72%.
Определение нуклеотидных полиморфизмов при внутриматочных синехиях продемонстрировало наиболее показательные результаты у пациенток с вторичным бесплодием. Была увеличена экспрессия минорных аллелей LIF rs9292271 (T/T), MDM4 rs1563828 (A/A), TP53 rs1042522 (G/G).
Исследование генотипов при хроническом эндометрите продемонстрировало также высокую выявляемость LIF rs9292271 (T/T), MDM2 rs2279744 (T/G) в группе пациенток с вторичным бесплодием.
В современной литературе появляется все больше данных о том, что определенную роль в готовности эндометрия к имплантации бластоцисты играют генетические маркеры, в частности гены сигнального пути TP53 [14—17]. Нами проанализированы результаты генетического исследования образцов эндометрия пациенток 3 групп (табл. 3). В ходе исследования генетических полиморфных вариантов выявлена связь с первичным бесплодием двух генетических вариантов ― rs9292271 в гене LIF — гомозиготного генотипа по минорному аллелю G/G (отношение рисков — ОР 7,76; p=0,0047) и гомозиготного генотипа по минорному аллелю G/G rs1563828 в гене MDM4 (ОР 5,75; p=0,0083). Ген фактора ингибирования лейкемии человека LIF, играющий ключевую роль в имплантации, является геном-мишенью для белка p53. Мы также получили схожие данные, а именно: у всех 53 пациенток с бесплодием в образцах эндометрия выявлен минорный аллель G/G LIF rs41281637 (G/A). В нашей работе мы проанализировали полиморфизм генов MDM4 и MDM2, которые также играют важную роль в процессе имплантации, а кроме того, избыточно экспрессируются в различных злокачественных опухолях человека. Присутствие аллеля A в полиморфизме rs1563828 гена MDM4 увеличивает экспрессию кодируемого этим геном белка — супрессора p53. Ингибирование p53, в свою очередь, приводит к снижению количества LIF и вероятности имплантации [8, 14, 16]. Полученные нами результаты свидетельствуют о связи полиморфизма гена MDM2 варианта T/G с первичным бесплодием и варианта T/T — с вторичным, полиморфизм гена MDM4 показывает связь варианта G/G с первичным бесплодием, а варианта A/A — с вторичным. При анализе полиморфизма гена TP53 обнаружена связь аллеля G/G с первичным бесплодием, а аллеля C/G — с вторичным. Полученные нами результаты экспериментальных исследований дополняют имеющиеся в настоящее время данные литературы и свидетельствуют о важном вкладе генетических полиморфизмов в генах сигнального пути TP53, LIF и MDM4 в развитие первичного, а MDM2 — вторичного бесплодия у женщин [16—20]. При сравнении полиморфизма генов у пациенток с бесплодием и такового пациенток контрольной группы в последней не определяется полиморфизм генов, характерных для 1-й и 2-й групп.
Заключение
Таким образом, включение в комплекс обследования женщин как с первичным, так и с вторичным бесплодием определения в эндометрии маркеров полиморфизма генов сигнального пути TP53 может способствовать значительному повышению качества диагностики состояния эндометрия, в том числе у пациенток перед проведением программы ЭКО, и лучшему прогнозированию реализации репродуктивного потенциала.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Т.А. Джибладзе, В.М. Зуев
Сбор и обработка материала — А.О. Путило, Е.А. Свидинская, Н.В. Позднякова, Н.Ю. Григорцевич
Статистическая обработка — А.О. Путило, М.Б. Агеев
Написание текста — А.О. Путило, Е.А. Свидинская
Редактирование — И.Д. Хохлова, Т.А. Джибладзе
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Participation of the authors:
Concept and design of the study — T.A. Dzhibladze, V.M. Zuev
Data collection and processing — A.O. Putilo, E.A. Svidinskaya, N.V. Pozdnyakova, N.Yu. Grigortsevich
Statistical processing of the data — A.O. Putilo, M.B. Ageev
Text writing — A.O. Putilo, E.A. Svidinskaya
Editing — I.D. Khokhlova, T.A. Dzhibladze
Authors declare lack of the conflicts of interests.