Серотонин (5-гидрокситриптамин, 5-HT, 3-(2-амино­этил)-1H-индол-5-ол) в организме человека образуется из незаменимой аминокислоты триптофана в ходе его окислительного распада по метоксииндольному пути. Около 98% триптофана, поступающего в организм с пищей, метаболизируется по кинурениновому пути и примерно 2% - метоксииндольному [1] (рис. 1).

Впервые серотонин был выделен в 1937 г. из слизистой кишечника и по способности сокращать его гладкие мышцы назван «энтерамином». Примерно в то же время M. Rapport и соавт. [2] выделили из сыворотки крови вещество, приводящее к сужению сосудов и повышению кровяного давления, назвав его «серотонин». В дальнейшем структура выделенного серотонина была подтверждена химическим синтезом [3]. В 1953 г. B. Twarog и I. Page [4] обнаружили серотонин в головном мозге. Было показано, что серотонин в основном (90-95%) синтезируется и хранится в энтерохромаффинных клетках кишечника, откуда поступает в кровь. Однако он также синтезируется в нейронах головного мозга и эпифизе. Серотонин в ЦНС играет роль важного нейромедиатора и нейромодулятора. Нарушения в функционировании серотониновой системы головного мозга вовлечены в патогенез психических и неврологических заболеваний [5-11]. Особенно широко распространена «серотониновая» гипотеза патогенеза депрессивных расстройств, согласно которой основной причиной развития депрессии является нарушение функционирования серотонинергических структур мозга.

В основу этой гипотезы был положен факт снижения у больных депрессией уровня серотонина в серотонинергических синапсах мозга и тромбоцитах крови [12, 13]. При этом была отмечена связь между снижением уровня серотонина и тяжестью депрессивного состояния [14].

Экстрацеребральной моделью серотонинергических нейронов считаются тромбоциты [15], в плотных гранулах которых содержится практически весь серотонин крови. Было показано [16], что содержание серотонина в тромбоцитах в 25 000 раз выше, чем в плазме крови. Была выявлена [17] корреляция между содержанием серотонина в тромбоцитах и цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) и плохая корреляция содержания серотонина в плазме и ЦСЖ.

В ряде работ была показана высокая диагностическая и прогностическая значимость измерения уровня тромбоцитарного серотонина при психических заболеваниях [8, 18, 19] и некоторых неврологических расстройствах, в частности при церебральном ишемическом инсульте [20]. Измерение концентрации серотонина в сыворотке крови, моче, тромбоцитах может быть использовано также для диагностики карциноидных опухолей [21] и заболеваний печени [22].

Вследствие способности серотонина к быстрому окислению кислородом [23] и сложностей, возникающих при работе с содержащими серотонин тромбоцитами (например, склонность тромбоцитов к агрегации и разрушению), разработка простых и точных методов анализа содержания серотонина в тромбоцитах является актуальной задачей.

Цель нашего исследования - разработка простого, точного и высокочувствительного метода определения тромбоцитарного серотонина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуоримет­рической детекцией с использованием гематологического анализатора для подсчета количества тромбоцитов.

Реактивы и растворители. В работе использовали ацетонитрил для ВЭЖХ («Merck», Art 17, США), изопропанол, перегнанный на ректификационной колонке, а также вспомогательные вещества - бикарбонат аммония, лимонная кислота, монофосфат аммония или азид натрия 99% («Sigma», США). Для приготовления стандартных растворов применяли гидрохлорид серотонина с чистотой не менее 99% («Acros Organics», США).

Для хроматографии использовали воду сопротивлением 10-18 мегаОм, получаемую из дистиллята, очищенного на установке для очистки воды Milli-Q («Millipore», США). Для хроматографии воду дополнительно перегоняли в режиме дефлегмации с использованием ректификационной колонки с призматической насадкой Зульцер.

Оборудование. Для центрифугирования вакутейнеров с К3ЭДТА и кровью и получения плазмы крови, обогащенной тромбоцитами (ПОТ), использовали центрифугу СМ6M («ELMI», Латвия) при 200 g в течение 10 мин. Центрифугу Allegra X-300 («Beckman Coulter», США) использовали для осаждения в присутствии К3ЭДТА тромбоцитов плазмы при 6000 g в течение 40 мин при 4 °С и осаждения разрушенных тромбоцитов в течение 20 мин. Встряхивание тромбоцитов проводили в орбитальном шейкере со скоростью встряхивания 600 оборотов в 1 мин и амплитудой от 3 мм.

Для подсчета тромбоцитов в цельной крови и плазме крови, обогащенной тромбоцитами, использовали гематологический анализатор KX-21N («Sysmex», Япония) (коэффициент вариации метода составлял от 4 до 10%).

С помощью микроскопа проводили проверочное определение содержания тромбоцитов на 1000 эритроцитов в мазке крови по Фонио [24] с целью проверки и подтверждения данных, полученных на гематологическом анализаторе (данные не приводятся).

Дегазацию растворителей для ВЭЖХ проводили с использованием мембранного вакуумного насоса KNF Laboport (модель №820.3 АN18, «Weigand International», Германия) в вакууме при перемешивании на магнитной мешалке.

Определение концентрации серотонина в образцах проводили на жидкостном хроматографе System GOLD («Beckman Coulter») c флуометрическим детектором FP-2020+ (JASCO, Япония), насосом модели 128 с двумя аналитическими головками по 10 мл, инжектором Rheodine 7725i и аналитической колонкой c C18 обращенной фазой Ultrasphere XL 3mм ODS (70×4,5 мм) («Beckman Coulter»). Обсчет хроматограмм производили с использованием программы 32 KARAT («Beckman Coulter») или любой другой подходящей программы обсчета на основе калибровочного графика, построенного для свежеприготовленных растворов гидрохлорида серотонина в 3% ацетонитриле с конечными концентрациями 0,21; 1,06; 2,12; 10,6; 21,3; 106,4; 212,8; 425,6 нг/мл (рис. 2).

Процедура забора крови и подготовка проб. Кровь из вены брали натощак в вакутейнер Vacuette Premium («Greiner Bio-one», Австрия), содержащий раствор К3ЭДТА [25, 26]. За 48 ч до забора крови из рациона исключали продукты, влияющие на содержание серотонина в клетках крови или моче (шоколад, сыр, бананы, инжир, яйца, орехи, кукурузу и т.д.). Обследуемые должны были воздерживаться от употребления алкоголя и табакокурения. Учитывали и использование лекарств, в частности серотонина адипината, золофта и т.д.

После забора крови в вакутейнер кровь центрифугировали при 200 g в течение 10 мин и получали ПОТ [26]. Определяли с помощью гематологического анализатора количество тромбоцитов в ПОТ и венозной крови в присутствии K3ЭДТА. Сразу после центрифугирования охлаждали ПОТ до +4°С и разливали в пластиковые пробирки с круглым дном по 400 мкл. (В дальнейшем все процедуры проводили при 4±2 °С, поскольку при более высокой температуре серотонин окисляется.) Затем тромбоциты осаждали центрифугированием при 6000 g в течение 40 мин при 4 °С, аккуратно декантировали верхний водный слой.

После центрифугирования в водном слое плазмы определяли содержание серотонина при помощи ВЭЖХ для контроля метода.

К осадку тромбоцитов, находящемуся в пластиковой пробирке, добавляли 400 мкл дистиллированной воды, охлажденной до 4±2 °С и затем разбивали тромбоциты на шейкере в течение 0,5 мин. Потом пробирку замораживали при –80 °С и не раньше чем через 1 ч размораживали и центрифугировали при 6000 g в течение 20 мин при 4 °С. Из полученного супернатанта отбирали 20 мкл и проводили аналитическую хроматографию на колонке с С18 обращенной фазой.

Хроматографическое определение концентрации серотонина. Высокоэффективную жидкостную хроматографию проводили на хроматографе («Beckman Coulter») с конфигурацией, описанной выше. Детектирование флюо­ресценции серотонина осуществляли при длине волны поглощения 300 нм и испускания 330 нм, при коэффициенте усиления 100 и ширине спектральной линии 18 нм.

При хроматографии в качестве буфера А использовали растворенные в 1 л перегнанной воды с сопротивлением 10-18 мегаОм 2336 мг лимонной кислоты, 1346 мг монофосфата аммония, 413 мг динатриевой соли ЭДТА, 918 мг бикарбоната аммония и 100 мг азида натрия. Дегазацию буфера А проводили в вакууме насоса KNF Laboport при 10 мм рт.ст. 25-30 мин, до окончания выделения углекислого газа, при этом получали буферный раствор с pH 4,05-4,20. В качестве буфера В использовали смесь 200 частей ацетонитрила и 20 - воды или смесь 200 частей перегнанного изопропанола и 15 - воды. Буфер В дегазировали в течение 2-3 мин. После данной процедуры буферная система В может храниться в плотно закрытом сосуде 1 нед при 4±8 °C. При уменьшении концентрации ацетонитрила и увеличении времени удерживания серотонина буфер В заменяют. Буфер А можно хранить в холодильнике 1 мес.

Хроматографию водных или водно-органических экстрактов тромбоцитов, содержащих серотонин, проводили изократическим элюированием со скоростью потока 1,5 мл/мин 4% буфера В в буфере А в течение 2,5 мин; далее колонку отмывали от примесей линейным градиентом от 4 до 70% буфера В от 2,5 до 3 мин; от 3 до 5 мин колонку промывали 70% буфера В; затем от 5 до 10,5 мин колонку переуравновешивали 4% буфера В. Время удерживания серотонина на колонке составляло 1,65-2,15 мин и не изменялось после проведения более 1000 определений серотонина. Примеси, которые могут содержаться в использованной воде или образце экстракта тромбоцитов, элюировались с временем удерживания 0,45-0,6 и 4,7-6,8 мин. Время удерживания триптофана составляло 3-3,4 мин.

Перед нанесением на колонку растворы серотонина можно хранить в холодильнике при 4 °С или в замороженном виде при –15 °С и размораживать перед определением холодной водой.

Хроматограммы обсчитывали с использованием программы 32 KARAT («Beckman Coulter») или другой подходящей программы на основе калибровочной кривой, полученной для навесок гидрохлорида серотонина (см. рис. 2). Типичная хроматограмма водного экстракта разрушенных тромбоцитов приведена на рис.3.

После забора пробы и проведения хроматографии пластиковую пробирку с раствором серотонина можно замораживать и хранить при –80 °С до 1 года.

Разработанный метод определения концентрации тромбоцитарного серотонина включает получение из крови ПОТ, при центрифугировании крови в присутствии К3ЭДТА при 200 g в течение 10 мин; быстрый подсчет количества тромбоцитов в ПОТ на гематологическом анализаторе в 10⁹ клеток/мл (N); осаждение тромбоцитов в 400 мкл ПОТ высокоскоростным центрифугированием, декантирование супернатанта, суспендирование осадка тромбоцитов в объеме воды (или воды с 3-4% органического растворителя), равном объему ПОТ с последующим разрушением тромбоцитов замораживанием для выделения из них серотонина, размораживание жидкости с разрушенными тромбоцитами, ее центрифугирование и получение водного экстракта, содержащего тромбоцитарный серотонин; проведение ВЭЖХ и определение содержания в водном растворе тромбоцитарного серотонина в нг/мл (С) на основе калибровочного графика (см. рис. 2), полученного для стандарта - гидрохлорида серотонина (мол. вес W=212,68) (процедура построения калибровочного графика приведена ниже); расчет концентрации тромбоцитарного серотонина (СТ) в нмоль/10⁹ тромбоцитов по формуле СT=С/(N·W).

Так, например, при определении на гематологическом анализаторе количества тромбоцитов: N= 0,054·10⁹ клеток/мл. Определенное по ВЭЖХ значение концентрации серотонина в разрушенных тромбоцитах - 56,0 нг/мл. Соответственно содержание серотонина в тромбоцитах - CT=56,0/(0,054·212,68)=4,87 нмоль/10⁹, что практически соответствует верхней границе нормы.

Разработанным методом были проведены измерения концентраций тромбоцитарного серотонина у 30 больных с клинической картиной депрессивного расстройства и 10 здоровых (контроль). У здоровых были получены концентрации серотонина в интервале от 2,19 до 4,87 нмоль/10⁹ тромбоцитов, у больных они находились в интервале от 0,11 до 2,89 нмоль/10⁹ тромбоцитов. Полученные значения концентрации серотонина у больных были не только ниже показателей у здоровых, но и коррелировали с клинической оценкой состояния больных. Таким образом, разработанный метод определения концентрации тромбоцитарного серотонина может быть использован вместе с другими клиническими методами для диагностики депрессивных расстройств.

Описанные в литературе нормальные значения концентраций тромбоцитарного серотонина в нмоль/10⁹ тромбоцитов находятся в следующих интервалах: для новорожденных 1,67±0,74; для детей 4,09±1,04; для взрослых 3,87±0,87; для пожилых 2,57±1,12 [27], что также иллюстрирует применимость разработанного метода.

Для построения калибровочного графика использовались растворы, полученные из навески ~5 мг гидрохлорида серотонина с 99% хроматографической чистотой. Чистота подтверждалась тонкослойной хроматографией (ТСХ) на силикагеле Merk Art 5642 в системах этилацетат - уксусная кислота: вода 3:1:1 (Rf 0,50) и н-бута­нол:уксусная кислота: вода 4:0,5:5,5 (Rf 0,51). При ТСХ нанесенный серотонин проявлялся одним пятном в УФ свете или при помощи проявителей для ТСХ [28, 29]. При построении калибровочного графика на колонку с С18 обращенной фазой наносилось по 20 мкл образца c растворенными навесками гидрохлорида серотонина в указанных выше концентрациях. При проведении хроматографии для образцов с навесками серотонина измерялась и обсчитывалась площадь пиков флюоресценции растворов гидрохлорида серотонина при ВЭЖХ с использованием функции Area и программного обеспечения KARAT 32 («Beckman Coulter»). Полученный график описывается уравнением С=0,0001·S, где С - концентрация серотонина в нг/мл, S - площадь хроматографического пика, определенная по функции Area. Калибровочный график является линейным во всей области концентраций от 0,2 до 425 нг/мл, в которой производится определение серотонина в тромбоцитах (см. рис. 3).

Предел детекции гидрохлорида серотонина в 3% ацетонитриле составляет 0,2 нг/мл при отношении величин сигнала к шуму, равном 3:1. При работе с образцами серотонина, выделенного из разрушенных тромбоцитов, калибровка оборудования проверялась перед проведением анализов проверочной хроматографией стандартных растворов гидрохлорида серотонина в 3% водном ацетонитриле.

Подчеркнем, что разработанный метод включает быструю и точную стадию определения содержания количества тромбоцитов в ПОТ на гематологическом анализаторе и определение концентрации серотонина с помощью ВЭЖХ с флуометрической детекцией. Методы определения серотонина, включающие его электрохимическое детектирование, являются недостаточно надежными из-за адсорбции компонентов из разрушенных тромбоцитов на электроде и возникающих затруднений при проведении анализов. Методы, включающие детектирование серотонина при ВЭЖХ в УФ-области, недостаточно чувствительны для клинического применения.

При постановке анализа разработанным флюоресцентным хроматографическим методом в отличие от метода с использованием иммуноферментного анализа (ИФА) не используются дорогостоящие антитела [25]. Разработанный хроматографический метод по сравнению с ИФА включает меньшее число стадий, обладает большей специфичностью и возможностями проверки другими независимыми хроматографическими методиками, позволяет анализировать единичные образцы и их серии и многокомпонентные смеси с высокой производительностью. Метод, основанный на ВЭЖХ, может быть улучшен с целью определения концентраций нескольких веществ в смесях. В то же время метод, основанный на ИФА, не имеет такой возможности. Растворители, используемые при ВЭЖХ, можно регенерировать с использованием ректификации, перегонок, а также кристаллизации при пониженных температурах. Проведение регенерации растворителей повышает экономичность хроматографии.

Таким образом, разработанный метод ВЭЖХ с флуометрической детекцией серотонина имеет преимущества по сравнению с другими методами анализа.

Относительно сложностей при использовании для анализа метода ВЭЖХ необходимо отметить, что из-за высокой чувствительности метода обычно используемая вода, получаемая путем очистки на системе водоподготовки Milli-Q reagent water system («Millipore», США), нуждается в дополнительной очистке перегонкой с использованием ректификационной колонки из-за появления при градиентном элюировании лишних пиков примесей с временем удерживания 0,45-0,6 и 4,7-6,8 мин (см. рис. 3). При проведении работ было установлено, что использование при ВЭЖХ воды, полученной на указанной системе водоочистки и перегнанной в режиме дефлегмации в ректификационной колонке со стальной спиральной призматической насадкой Зульцер, позволяет получать при хроматографии с флюоресцентным детектором ровную базовую линию при градиентном элюировании от 3 до 60% ацетонитрила (рис. 4).

Используемые в разработанном методе параметры центрифугирования были уточнены по сравнению с опуб­ликованными [30]. Было показано, что для точного и качественного определения необходимо более длительное центрифугирование для осаждения тромбоцитов. Параметры центрифугирования контролировали при помощи ВЭЖХ по потерям серотонина в супернатантах. Было показано, что большая длительность центрифугирования необходима для осаждения разрушенных тромбоцитов и их фрагментов в присутствии K3ЭДТА и обеспечения надежности работы хроматографической колонки.

Использование изократического режима элюирования с 3-4% содержанием ацетонитрила или изопропанола является более выгодным для определения тромбоцитарного серотонина по сравнению с системами с 7-10% содержанием неполярного компонента (ацетонитрил [31], алифатический спирт [30, 32]), поскольку более высокий процент неполярной фазы способен постепенно вымывать с колонки примеси, мешающие хроматографическому определению. Преимуществами изопропилового спирта по сравнению с ацетонитрилом являются невысокая цена, доступность и низкая токсичность. К недостаткам изопропанола по сравнению с ацетонитрилом можно отнести высокую вязкость.

Полученные данные позволяют утверждать, что хроматографический метод является достаточно быстрым, надежным и может быть автоматизирован для клинических определений. Ошибка метода, обусловленная потерями при центрифугировании, составляет менее 1%, поскольку величины концентраций серотонина в супернатантах, полученных после осаждения тромбоцитов, были значительно ниже предела определения серотонина. Было показано, что разработанный хроматографический метод определения серотонина хорошо воспроизводится при проведении серий анализов.

Процедуры подсчета тромбоцитов, определения концентрации тромбоцитарного серотонина значительно упрощены по сравнению с ранее описанными методами. Разработанные подходы могут быть использованы для проведения анализов тромбоцитарного серотонина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрической детекцией в условиях клинической лаборатории и для решения медико-биологических проблем.