Ишемический инсульт (ИИ) развивается в результате взаимодействий факторов риска и генетической компоненты, которая формируется в результате вклада множества независимо действующих или взаимодействующих полиморфных генов [1]. Определение генетических предрасположенностей к ИИ может позволить выявлять людей с повышенным риском и тем самым предотвратить ИИ в клинической практике [2]. Исследователи постоянно ведут поиск точных маркеров для оценки риска развития И.И. Комплексный анализ генетической предрасположенности показал, что носительство определенных аллелей гена апо-липопротеина Е (APOE), кодирующего компоненты системы липидного метаболизма, является фактором предрасположенности к ИИ у этнических русских [3]. Выявлена связь между риском развития ИИ и носительством «протективного» или «аллеля риска» IL-6 у этнических русских [4]. Определены полиморфизмы гена CYBA, влияющего на формирование клеточного редокс-статуса, ассоциированные с риском развития ИИ [5]. Имеются доказательства повышения риска возникновения ИИ при неблагоприятных условиях окружающей среды и наличии сопутствующей патологии сердечно-сосудистой системы [6]. Получены результаты, свидетельствующие о важной роли воспаления при И.И. Обнаруженные авторами одиночные и составные маркеры генов системы воспаления могут быть использованы для определения индивидуального риска развития ИИ [7].

В других популяционных исследованиях в поисках маркеров выявляли высокий риск развития ИИ, связанный с наличием определенного полиморфизма гена, кодирующего белок, который активирует 5-липоксигеназу (ALOX5AP) [8], в качестве фактора риска также рассматривают носительство полиморфизма в положении C148T гена β-фибриногена [9]. Получены и отрицательные результаты при поиске генетических маркеров: MCP-1 — 2518A/G, LPL (rs320, rs285 и rs328) — даже на больших выборках [10, 11].

В настоящем исследовании предпринята попытка выявить некоторые генетические маркеры риска развития ИИ в популяции этнических русских Западно-Сибирского региона.

Цель исследования — изучение влияния носительства полиморфизмов генов системы перекисного окисления липидов на риск развития ИИ.

Основную группу исследования составили 746 пациентов с ИИ различной давности, средний возраст которых достигал 67,89±0,42 года. В контрольную группу вошли 500 пациентов без острых нарушений мозгового кровообращения (ОМНК) в анамнезе, без клинических факторов риска развития инсульта, средний возраст 54,42±0,55 года. В соответствии с дизайном исследования пациенты группы с ИИ были подразделены на 2 подгруппы: 1-я подгруппа — пациенты с отрицательной динамикой или без таковой, 2-я подгруппа — пациенты с положительной неврологической динамикой. Оценку изучаемых показателей выполняли после проведения комплекса лечебно-реабилитационных мероприятий. Группы пациентов были сопоставимы по гендерно-возрастным характеристикам. Для оценки корреляций между носительством полиморфных вариантов генов и течением реабилитационного периода определены частоты генотипов по редким аллелям изучаемых генов в соответствии с разделением пациентов с ИИ на подгруппы.

Характеристика клинических наблюдений. Наблюдали 151 пациента с ИИ: 67 (44,4%) женщин и 84 (55,6%) мужчин, средний возраст 67,6 года, сроки давности инсульта от 1 мес до 5 лет. Длительность наблюдения составила 3 года для 52 (34,4%) пациентов, которые прошли от 3 до 6 курсов реабилитационного лечения; 2 года — для 64 (42,4%), получивших от 1 до 4 курсов; 1 год — для 48 (31,8%), прошедших 1—2 реабилитационных курса. Из 151 больного 24 (15,9%) прекратили реабилитационное лечение в связи с различными обстоятельствами (смерть, социальные и бытовые факторы).

Реабилитационные мероприятия динамичны по своему характеру и зависят от целого ряда факторов: психологические особенности личности больного, этиология и характер заболевания, характер и тяжесть развившегося дефекта функции, социальное положение больного и его профессия до болезни. Кроме того, эти мероприятия зависели от выраженности неврологического дефекта, наличия сопутствующей патологии, отсутствия противопоказаний к применению каждого метода лечения.

Комплексная программа реабилитационного лечения пациентов с ОМНК включала следующие пункты.

1. Лекарственная терапия, направленная в основном на профилактику повторных нарушений мозгового кровообращения, миорелаксанты при выраженной спастичности, психотропные и противоэпилептические средства.

2. Лечебная физкультура, включающая пассивные и активные движения конечностей.

3. Специальный дифференцированный массаж.

4. Иглорефлексотерапия.

5. Фармакорефлексопунктура как один из методов рефлексотерапии.

6. Электростимуляция мышц с использованием аппарата ЭСМА.

7. Методика электромиографического биологического управления с обратной связью.

8. Тренинг на стабилоплатформе для восстановления функции удержания равновесия в вертикальном положении.

9. Рео- и миографические тренинги для улучшения кровообращения головного мозга и усиления или создания альфа-ритма.

10. Психотерапевтическая коррекция.

Молекулярно-генетические методы. Для молекулярно-генетического исследования забиралась венозная кровь путем пункции локтевой вены. Образцы ДНК для генотипирования получены методом фенол-хлороформной экстракции из цельной венозной крови, стабилизированной 2,5% раствором ЭДТА в отношении 10:1, в полном соответствии с протоколом [12]. Молекулярно-генетическое исследование включало полиморфные варианты генов: HIF1a С1772Т, ApoE Ɛ2/Ɛ3/Ɛ4, MnSOD С47Т, GPX-1 С599Т, BDNF G196T, p22phox С242Т.

Генотипирование однонуклеотидных замен. Данные полиморфные варианты представляют собой однонуклеотидные замены, которые могут быть зарегистрированы по появлению или потере сайтов узнавания для ферментов эндонуклеазной рестрикции, что проявляется на электрофореограмме полиморфизмом длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в конечном объеме 15 мкл, содержащем 650 мМ трис-HCl (рН 8,9), 160 мМ сульфата аммония; 20 мМ MgCl₂; 0,05% Tween 20; 2 мM dNTP; 0,5 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров, 20—100 нг ДНК и 1 ед. Taq-полимеразы. Реакцию проводили на амплификаторе «Eppendorff» с начальной денатурацией при температуре 95 °C в течение 3 мин, затем на протяжении 42 циклов с денатурацией в течение 5 с при температуре 95 °C, отжигом в течение 5 с при Т_отжига и элонгацией 15 с при температуре 72 °C. Финальную элонгацию проводили при температуре 72 °C в течение 5 мин. Структуры праймеров и температура их отжига, длины амплифицированных фрагментов, эндонуклеазы рестрикции и длины получаемых фрагментов, используемые для типирования полиморфных локусов методом ПДРФ-анализа, представлены в табл. 1.

Для ПДРФ-анализа полученных фрагментов ДНК рестрикцию осуществляли следующим образом. К амплификационной смеси добавляли ¹/₁₀ объема 10-кратного буфера для рестрикции и эндонуклеазу рестрикции (1—3 ед. акт. фермента) и инкубировали 2 ч при температуре 65 °C. Буфер для рестрикции использовали с учетом рекомендаций производителя эндонуклеазы рестрикции. Фермент инактивировали добавлением 1 мкл 0,5 М ЭДТА.

Анализ продуктов гидролиза проводили в 7% полиакриламидном геле, который окрашивали бромистым этидием с визуализацией ДНК ультрафиолетовым светом, затем фотографировали с помощью цифровой видеокамеры Vatec (Япония).

Генотипирование однонуклеотидных замен (англ.: single nucleotide polymorphism — SNP) в реальном времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов, комплементарных полиморфным участкам ДНК. Разработаны методы генотипирования однонуклеотидных замен в генах MnSOD, BDNF, GPX1 и ApoE с помощью ПЦР в реальном времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов, комплементарных полиморфным участкам ДНК. Зонды отличаются по структуре на один нуклеотид, соответствующий SNP (находится в центре олигонуклеотидного зонда). В реакционной смеси зонды конкурируют друг с другом за гибридизацию с матрицей. При полной комплементарности матрицы и зонда гибридизация эффективнее, чем в случае неполной комплементарности. Следовательно, накопление флуоресцентного сигнала, соответствующего полностью комплементарному зонду, преобладает.

Основным параметром, который мы учитывали для каждой из реакций, являлось соотношение значений флюоресценции (в относительных единицах флюоресценции (англ.: relative fluorescence unit, RFU) в диапазонах эмиссии красителей FAM и R6G. Важным критерием достоверности генотипирования служила кластеризация генотипов в группы, строившаяся на основе показателей интенсивности флюоресценции (в RFU).

Статистические методы. Полученные данные подвергали статистической обработке с вычислением средней арифметической (М) и стандартной ошибки средней арифметической (m). Достоверность различий сравниваемых параметров рассчитывалась с использованием критерия Стьюдента, величины нормированного отклонения Z и F — распределения вероятности. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Расчет производили с использованием пакета статистических программ Statistica 6.0.

Частоты аллелей и генотипов определяли прямым подсчетом. Оценку отклонения распределений генотипов изученных полиморфизмов ДНК от канонического распределения Харди—Вайнберга и анализ ассоциативных связей внутри генотипических сочетаний, а также оценку степени различий по частоте аллелей, генотипов и межгенных комбинаций между исследуемыми группами проводили с помощью точного критерия Фишера. Расчет показателя отношения шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ) и значения р проводился с помощью онлайн-калькулятора [13].

Связь риска развития ОНМК с носительством полиморфизмов генов системы перекисного окисления липидов среди пациентов Сибирского региона. Распределения аллелей всех генов соответствуют равновесию Харди—Вайнберга (p>0,1). При рассмотрении распределения частот генотипов обращает на себя внимание большее число пациентов с гомозиготным генотипом по редкому аллелю Т гена MnSOD в группе контроля — 29,7% против 22,1% среди пациентов с И.И. Однако для гетерозиготных генотипов отмечена обратная тенденция — в группе с ИИ его носителей больше на 4,1%. Распределение частот генотипов по изученным полиморфным вариантам в каждой группе в процентных соотношениях представлено в табл. 2.

При сравнительном анализе распределения редкого аллеля гена глутатионпероксидазы MnSOD выявлена тенденция к развитию протективного эффекта у его носителей; риск развития инсульта у его гомо- и гетерозиготных носителей, а также общий риск снижен от 0,641 до 0,822 соответственно. Однако статистически значимых различий не обнаружено (p>0,05), что не позволяет рассматривать MnSOD как достоверный диагностический маркер. При сравнении частот полиморфных аллелей генов GPX-1 и p22phox статистически значимых различий не обнаружено. Распределение относительно риска развития ИИ близко к единице во всех случаях, p>0,1. При сравнении частот полиморфных аллелей гена BDNF статистически значимых различий не обнаружено. Распределение относительно риска развития ИИ приближается к единице во всех случаях, p>0,1. Таким образом, корреляций между носительством редких аллелей генов BDNF, GPX-1 и p22phox и риском развития ИИ не выявлено.

Ввиду наличия в гене АроЕ трех полиморфных аллелей — Ɛ2, Ɛ3 и Ɛ4, был проведен двухступенчатый анализ частот генотипов по этим аллелям относительно Ɛ2 и Ɛ4. При этом в первом случае условно диким типом считали генотипы Ɛ3/Ɛ3, Ɛ3/Ɛ4, Ɛ4/Ɛ4, гетерозиготами — Ɛ2/Ɛ3 и Ɛ2/Ɛ4, гомозиготным вариантом по редкому аллелю — Ɛ2/Ɛ2. Аналогично в случае анализа относительно аллеля Ɛ4 условно диким типом считали генотипы Ɛ2/Ɛ2, Ɛ2/Ɛ3, Ɛ3/Ɛ3, гетерозиготами — Ɛ2/Ɛ4 и Ɛ3/Ɛ4, гомозиготным вариантом по редкому аллелю — Ɛ4/Ɛ4. При сравнении частот полиморфных аллелей гена АроЕ статистически значимых различий не обнаружено. Относительный риск развития ИИ приближается к единице во всех случаях, р>0,1. Таким образом, корреляций между носительством полиморфных аллелей Ɛ2 и Ɛ4 гена АроЕ и риском развития ИИ не выявлено.

В результате статистического анализа частоты показано, что носительство полиморфного аллеля Т гена HIF1a статистически значимо увеличивает риск развития ИИ (ОШ 1,603; p=0,01058). Для гетерозиготных носителей аллеля Т риск развития ИИ выше в 1,952 раза (p=0,00460), а для гетеро- и гомозигот по редкому аллелю ТТ — в 1,922 (p=0,00474) раза по сравнению с обладателями дикого генотипа С.С. Общий риск для данного аллеля составляет ОШ 1,702 (р=0,00711), что указывает на наличие корреляций между полиморфным вариантом гена HIF1a и высоким риском развития И.И. Результаты статистического анализа представлены в табл. 3.

Корреляции частоты полиморфизмов генов и особенностей течения реабилитационного периода у больных после ОНМК. В результате реабилитационного лечения у 139 (92,1%) пациентов отмечалась положительная неврологическая динамика: нарастание силы в паретичных конечностях у 107 (70,9%); уменьшение вестибулоатактических нарушений у 66 (43,7%); улучшение когнитивных функций у 23 (15,2%); уменьшение расстройств чувствительности парализованных конечностей у 69 (45,7%); сочетание улучшения состояния в нескольких сферах у 122 (80,8%).

У 12 (7,9%) пациентов динамики не наблюдалось. По нашим наблюдениям, это связано с изначально сниженными интеллектуально-мнестическими функциями, снижением способности к обучаемости.

Кроме клинических и функциональных методов исследования, использовалось тестирование пациентов по неврологическим шкалам. Функциональные шкалы включают измерения инвалидизации или зависимости в повседневной жизненной активности, а также функциональной независимости. Эти шкалы позволяют объективизировать динамику симптомов и функциональных нарушений, оценить эффективность реабилитационных мероприятий. По шкале Бартел средняя оценка у пациентов, наблюдавшихся в течение 3 лет, составила 87 баллов, у проходящих лечение 2 года — 63 балла, после первого года лечения — 38 баллов. Исходная средняя оценка по шкале Бартел у обследованных пациентов составила 18 баллов. При оценке по шкале Рэнкина перешли с 3-й на 2-ю стадию 20% пациентов после 3 лет наблюдения, 16% — после 2 лет наблюдения, 9% — после 1 года наблюдения.

Так, улучшение микроциркуляции в паретичных конечностях по данным электромиографии (в виде нарастания М-волны), а также нервной проводимости мышц паретичных конечностей отмечено у 107 (70,9%) пациентов.

По данным инфракрасной плетизмографии улучшение отмечено в 113 (74,8%) случаях, по результатам лазерной допплеровской флоуметрии — у 91 (60,3%); по данным тепловизионного исследования улучшение кровотока в паретичных конечностях отмечено лишь у 85 (56,3%) пациентов. Результаты инфракрасной термографии высокого разрешения свидетельствовали о поздних нарушениях микроциркуляции в паретичных конечностях у 100% больных.

При рассмотрении распределения частот генотипов обращает на себя внимание большее число пациентов с гетерозиготным генотипом по редкому аллелю Т гена GPX-1 в 1-й подгруппе: 51,1% против 40,3% в 2-й подгруппе. Однако для гомозиготных генотипов отмечена обратная тенденция — во 2-й подгруппе его носителей больше на 3,3%.

Кроме того, для редкого аллеля Т гена BDNF выявлено большее число носителей гетерозиготного генотипа в 1-й подгруппе, чем в 2-й подгруппе: 39,9 и 33,6% соответственно. Гомозиготные варианты на 8% чаще встречаются в 2-й подгруппе; таким образом, тенденции также разнонаправленные.

Для частот генотипов прочих рассмотренных генов — MnSOD, p22phox, HIF1a, ApoE — статистически значимых различий не обнаружено, разница между подгруппами составляет не более 2—3% во всех случаях. Распределение частот генотипов по изученным полиморфным вариантам в каждой подгруппе в процентных соотношениях представлено в табл. 4.

При сравнении частот полиморфных аллелей генов MnSOD, GPX-1, p22phox, HIF1a статистически значимых различий не обнаружено. Распределение относительно риска развития ИИ приближается к единице во всех случаях, p>0,1. Таким образом, корреляций между носительством редких аллелей генов MnSOD, GPX-1, p22phox, HIF1a и особенностями течения периода реабилитации после ИИ не выявлено.

Ввиду наличия в гене АроЕ трех полиморфных аллелей — Ɛ2, Ɛ3 и Ɛ4 был проведен двухступенчатый анализ частот генотипов по этим аллелям относительно Ɛ2 и Ɛ4. При этом в первом случае условно диким типом считали генотипы Ɛ3/Ɛ3, Ɛ3/Ɛ4, Ɛ4/Ɛ4, гетерозиготами — Ɛ2/Ɛ3 и Ɛ2/Ɛ4, гомозиготным вариантом по редкому аллелю — Ɛ2/Ɛ2. Аналогично в случае анализа относительно аллеля Ɛ4 условно диким типом считали генотипы Ɛ2/Ɛ2, Ɛ2/Ɛ3, Ɛ3/Ɛ3, гетерозиготами — Ɛ2/Ɛ4 и Ɛ3/Ɛ4, гомозиготным вариантом по редкому аллелю — Ɛ4/Ɛ4. При сравнении частот полиморфных аллелей гена АроЕ статистически значимых различий не обнаружено. Относительный риск развития ИИ приближается к единице во всех случаях, p>0,1. Таким образом, корреляций между носительством полиморфных аллелей Ɛ2 и Ɛ4 гена АроЕ и особенностями реабилитационного периода после ИИ не выявлено.

В настоящей работе исследованы 6 SNPs — полиморфных вариантов генов, детерминирующих функции ферментов системы перекисного окисления липидов, в качестве возможных предикторов развития ИИ и его осложненного течения. Несмотря на то что для изучения были выбраны патофизиологически обоснованные полиморфизмы, описанные в литературе как статистически значимые молекулярно-генетические факторы риска развития различных подтипов ИИ, оказалось, что 5 из 6 потенциальных факторов не вносят статистически значимого вклада в риск развития ИИ в популяции этнических русских Западно-Сибирского региона. Согласно данным литературы, для абсолютного большинства генов-кандидатов при изучении степени риска выявлен разнонаправленный вклад в вероятность развития ИИ, в прогноз заболевания и перспективы реабилитации. В частности, в 2014 г. опубликованы данные [14] о том, что носительство аллельных вариантов гена BDNF и обусловленное ими изменение функций фермента не вносит вклада в риск развития ИИ, однако, вероятно, отрицательно сказывается на прогнозе. Рассмотрение иных аллельных вариантов генов перекисного окисления липидов, описанных в работе, также может выявить особенности локальных популяций в отношении риска развития ИИ [15].

Результаты молекулярно-генетического исследования в группе с ИИ и контрольной группе, а также сравнительный анализ между подгруппами с различным течением периода реабилитации после ИИ показали, что носительство полиморфизма С1772Т гена HIF1а является статистически значимым маркером высокого риска развития И.И. Полученные результаты в отношении полиморфизмов генов BDNF и GPX-1 свидетельствуют о влиянии не только не риски развития самого инсульта, но и на результаты лечения и реабилитации после перенесенного заболевания. Несмотря на то что статистически значимого влияния на прогноз исхода заболевания и реабилитационных мероприятий не выявлено, данный опыт изучения влияния полиморфизмов на клиническую симптоматику является ценным и должен быть подтвержден дальнейшими исследованиями с увеличением числа больных.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: doctor.morozov@mail.ru